Теоретическая часть. Диализом называется процесс разделения низко и высокомолекулярных веществ с использованием полупроницаемых перегородок (мембран).

Диализом называется процесс разделения низко и высокомолекулярных веществ с использованием полупроницаемых перегородок (мембран).

Молекулы низкомолекулярных веществ, диаметр которых значительно меньше диаметра пор, свободно проходят через мембрану, тогда как для высо­комолекулярных соединений мембрана непроницаема. Этот принцип положен в основу использования диализа в препаративных целях.

Чтобы процесс диализа был высокоэффективен, необходимо длительное время поддерживать значительную разность концентраций по ту и другую сто­рону полупроницаемой мембраны. Этого можно достигнуть в специальных ап­паратах- диализаторах, работающих в непрерывном режиме при различном по­токе для диализируемого раствора и омывающего мембраны раствора. Уста­новки для диализа состоят из набора кассет (ячеек), в которых череду­ется каналы для протока воды и ферментного раствора, разделенные полупро­ницаемыми мембранами.

В лабораторной практике для диализа чаще всего используют специальные трубки из модифицированной целлюлозы, либо мешочки, изготовленные из листового целлофана. Наибольшей известностью пользуются специальные трубки для диализа (Viskingcellulose tubing).

Часто диализные трубки и листовой целлофан для придания им эластично­сти пропитывают при изготовлении смесью глицерина с водой, которая легко удаляется при промывании водой. Отмытый от смягчителей материал не следу­ет держать на воздухе, так как он делается ломким и, кроме того, при высыха­нии изменяется степень порозности. Влажные трубки для диализа целесообраз­но хранить в замороженном состоянии или же в присутствии антисептика. Ис­пользуется обычно изотонический диализ, позволяющий избавится от 2/3 бал­ластных веществ, в 3-10 раз повышать активность ферментных соединений.

Поскольку партии целлофана и диализные трубки бывают загрязнены и могут содержать примеси ионов металлов, рекомендуется непосредственно пе­ред использованием прокипятить их в течение 2-5 мин в 0,01-0,005 растворе этилендиаминтетрацетата.

Установка для непрерывного диализа состоит из ячеек, верхней пластины, отверстий для крепежных болтов, делительной воронки для ферментного раствора. Также установка имеет патрубок для ввода ферментного раствора, канавку с отверстиями, ведущими в коллектор, резиновые прокладки, нижнюю пластину, приёмник для диализованного раствора с ледяной баней, патрубок для вывода воды, бороздки треугольной формы и полупроницаемую мембрану.

Мембрану (ЭДТА) необходимо выдержать при рН 7 и затем отмыть несколько раз во­дой. Трубку, мешочек или плоский диализатор перед диализом необходимо проверить на герметичность.

При установке образца на диализ необходимо добавить к нему антисептик и проследить за тем, чтобы уровень жидкости в мешочке был на 1-2 мм выше уровня внешней жидкости в сосуде, что позволяет определить возможную утечку диализуемого раствора.

По мере выравнивания градиента концентрации скорость диализа замедля­ется, поэтому рекомендуется проводить вначале обычный диализ, а на завер­шающих стадиях для удаления трудноудаляемых балластных веществ - элек­тродиализ.

Для обработки ферментных растворов чаще всего используется обычный изотонический диализ, позволяющий избавиться от 2/3 балластных веществ, повысить в 3-10 раз активность ферментных препаратов (в пересчете на сухое вещество), провести некоторое фракционирование комплекса ферментов по молекулярной массе и т.д. Но во всех случаях наблюдается увеличение объёма диализируемого раствора в 1,1 - 1,4 раза.