Ход работы. Получение экстракта из поверхностей культуры гриба.Перед проведением диализа готовят экстракт в диффузионной батарее простым настаиванием

Получение экстракта из поверхностей культуры гриба.Перед проведением диализа готовят экстракт в диффузионной батарее простым настаиванием, не заботясь о том, чтобы все ферменты перешли в раствор. Для приготовления экстракта берут 0,5 кг воздушно-сухой культуры, добавляют к ней 3 дм водопроводной воды, прогретой до 30° С , тщательно все переме­шивают и оставляют настаиваться 10-15 мин. Затем смесь фильтруют через два слоя марли и слегка отжимают. При таком способе удается отделить 1,2 - 1,5 дм³ фильтрата. Этот фильтрат используют для повторного настаивания на све­жей культуре, которую добавляют в фильтрат в количестве 0,25 - 0,30 кг. После настаивания смесь снова фильтруют и отбирают 0,6 - 0,7 дм³ второго фильтра­та. Вновь повторяют настаивание, внося во второй фильтрат 0,10-0,15 кг све­жей культуры. Объем третьего фильтрата обычно не превышает 0,25 - 0,30 дм³, содержание сухих веществ в таком экстракте составляет около 10%.

Очистка экстракта от взвеси.Экстракт из поверхностной культуры, полу­ченный таким способом, обычно содержит значительное количество взвеси. Его необходимо либо профильтровать через бумажный фильтр на воронке Бюхнера, либо процентрифугировать при частоте вращения 5000 мин ^-1 и осторожно декантировать с осадка. Экстракт должен быть абсолютно прозрачен и не должен содержать взвеси.

Анализ исходного экстракта. Перед проведением диализа часть экстракта (30-50 см³) отбирается для определения содержания сухих веществ, активно­сти ферментов, рН экстракта, содержание белка, золы, редуцирующих веществ.

Характеристика исходного экстракта оформляется в виде таблицы 7.

Таблица 7 - Характеристика исходного экстракта

Установка для периодического электродиализа состоит из водоотводящей системы, мешалки с элементарным приводом, от­секов для воды, электродов, полупроницаемой мембраны и системы подвода воды.

Монтаж диализационной установки и проведение диализа или электродиа­лиза. Для проведения лабораторных занятий монтируется диализная установка непрерывного или периодического действия. При работе на пластинчатом непрерывно-действующем диализаторе студенты собирают диализ­ную ячейку и тщательно проверяют ее на герметичность на воде. Затем ниж­нюю пластинку ячейки присоединяет к напорной склянке с водой, регулируя скорость подачи воды краном. Отходящая вода сбрасывается в канализацию.

Диализуемый раствор заливают в делительную воронку на 0,5 дм, и при­соединяет ее к коллектору верхней пластины: скорость подачи ферментного раствора регулируется краном делительной воронки или зажимом и задается приблизительно в 15-25 раз меньшей, чем скорость воды.

Приемник для диализованного раствора помещают в емкость со льдом. Ко­гда содержимое делительной воронки почти полностью пройдет через диализа­тор, процесс можно повторить, залив ферментный раствор из приемника вновь в делительную воронку и т.д.

Необходимо точно замерить объем ферментного раствора до диализа и по­сле, чтобы можно было определить степень разбавления его водой.

При работе на электродиализаторе студент заливает в две крайние секции воду, а в центральную - ферментный раствор. Вода в отсеки подается снизу и отбирается сверху. В секции с водой вводят пластины электродов от электровыпрямителя, в секцию с ферментным раствором — мешалку.

Длительность диализа периодического с перемешиванием и наложением электрического поля - 4-6 ч, непрерывный диализ осуществляется за 3-4 ч (2 оборота).

Анализ диализованного раствора. По истечении назначенного времени диализа из диализатора сливают продиализованный раствор, демонтируют установку и тщательно ее моют.

При анализе диализованного раствора замеряют объем полученного рас­твора, определяют содержание в нем сухих веществ, рассчитывают степень разбавления его по отношению к исходному экстракту, сумму сухих веществ во всем объеме исходного экстракта и во всем объеме диализованного раствора (разность этих величин покажет количество сухих веществ, диффундированных в процессе диализа через мембрану).

Например, известно, что на диализ было поставлена 300 см ³ раствора с со­держанием сухих веществ, определенных рефрактометрически, 9,3, а после диализа собрана 350 см диализованного раствора с содержанием сухих веществ 5,1, следовательно, в исходном растворе 9,3·300:100 = 27,90г СВ., в диализован-ном растворе — 5,1·350:100 = 17,85г СВ. Степень разбавления по данным этого опыта составляет 350:300= 1,17 раза. Количество веществ, вымытых при диали­зе, равно 27,90 - 17,85 = 10,05 г, что по отношению к исходным сухим веществам составляет 10,05·100:27,90 = 36,02%.

Далее в диализованном растворе определяются все те показатели, которые определялись в исходном экстракте (рН, редуцирующие вещества, белок, зола, активность ферментов и т.д.). Все эти показатели и их доверительные ошибки вносятся в протокол наблюдений.

Протокол наблюдений имеет следующий вид:

Наименования продуцента фермента____________________________ табл.2

Концентрация сухих веществ в экстракте%

Количество экстракта, поставленное на диализ, см³

Скорость протока воды дм /ч

Наименование и характеристика полупроницаемой мембраны___________

Скорость протока ферментного раствора (при использовании диализатора не­ прерывного действия)_________________________________________________ см /ч

Объем диализованного раствора дм³

Содержание сухих веществ в диализованном растворе %

Таблица 8 – Результаты исследований

Затем рассчитывается степень вымывания каждого анализируемого веще­ства при диализе, строится диаграмма и составляется итоговая таблица.

Таблица 9 - Анализируемые показатели

Контрольные вопросы

1 Принцип диализа и электродиализа.

2 Схемы установок для диализа.

3 Методика работа.

4 Методы анализа.