Молекулярная гибридизация

Гибридизация нуклеиновых кислот в растворе

Известно, что при нагревании водного раствора ДНК до 100^оС, а также при повышении рН до 13 двойная спираль ДНК денатурирует за счет разрушения водородных связей между основаниями антипараллельных комплементарных полинуклеотидных цепей. В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при температуре 65^оС вело к восстановлению структуры двойной спирали. Процесс восстановления структуры ДНК называется ренатурацией или гибридизацией. Процесс гибридизации, т.е. образования водородных связей между основаниями нуклеотидов происходит между любыми одноцепочечными полинуклеотидами, если они комплементарны: ДНК-ДНК, РНК-РНК, ДНК-РНК (рис. 40).

Рис. 40. Схема гибридизации полинуклеотидных цепей

Можно выделить основные этапы проведения экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот:

1. Двухцепочечную ДНК нагревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки полинуклеотидов расходятся.

2. Препарат денатурированных ДНК затем смешивают с другой денатурированной ДНК, или РНК.

3. Препараты далее медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК отжигаются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется “гибридная молекула”.

Анализ скорости отжига одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида. Кроме того, гибридизация нуклеиновых кислот представляет собой высокочувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов и применяется в различных модификациях как в растворе, так и на твердых подложках, например на нитроцеллюлозных фильтрах или нейлоновых мембранах.