ГЛАВА 21. (IGF-IR), находящиеся в обратной ориентации под контролем металлотионеинового промотора, активируемого ZnSO4

(IGF-IR), находящиеся в обратной ориентации под контролем металлотионеинового промотора, активируемого ZnSO₄. IGF-l вырабатывается в избыточном количестве клетками злокачественной глиомы, наиболее распространенной опухоли головного мозга, a IGF-1R — клетками карциномы предстательной железы.

Вектор, обусловливающий синтез «антисмысловой» мРНК IGF-1, трансфицировали в культуру клеток глиомы. Если ZnSO₄ в культуральной среде отсутствовал, то гиперпродукция IGF-1 опухолью сохранялась, если же в среду добавляли ZnSO₄, то она исчезала. В другом эксперименте изучали последствия введения крысам нетрансфицированных клеток глиомы и клеток, трансфицированных «антисмысловой» кДНК IGF-1. В первом случае опухоли развивались, а во втором — нет.

Если клетки карциномы предстательной железы крыс, трансфицированные «антисмысловой» кДНК IGF-IR, вводили мышам, то у них образовывались лишь небольшие опухоли или не образовывались совсем. Если же им вводили нетрансфицированные или трансфицированные нормальной кДНК IGF-1R клетки, то развивались опухоли большого размера. По-видимому, в обоих случаях «антисмысловая» РНК гибридизуется с комплементарной ей мРНК и ингибирует трансляцию IGF-1 и IGF-1R, предотвращая пролиферацию опухолевых клеток.

«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства

Терапевтический эффект синтетических «антисмысловых» олигонуклеотидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15—20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5'- или 3'-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Олигодезоксинуклеотиды разрушаются внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримиаиновые основания и дезоксирибозу (рис. 21.14). Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на сульфогруппу (рис. 21.14, Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют РНК—ДНК-дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу) Н, эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов — лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.

Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями (рис. 21.14, В и Г). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2'-углеродному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 1.14, Д и Е). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.

Проникновение «антисмысловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчить, поместив их в липосомы. Такая высоко-

Генная терапия 507

Рис. 21.14. Модификации «антисмысловых» олигонуклеотидов. А. Фосфодиэф ирная связь. Б. Тиофосфатная связь. В. Фосфорамидитная связь. Г. Полиамидная связь (пептидная нуклеиновая кислота). Д. 2'-О-метилрибоза. Е. С-5-пропинилцитозин.

эффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с сайтами связывания, специфичными для определенных клеток, то можно будет осуществлять адресную доставку олигонуклеотидов.

Проведенные доклинические испытания показали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекарственными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарных и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 мес вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили «антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного цикла млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.

«Антисмыдовые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с помощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов, В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у пациентов с болезнью Крона. Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.

В принципе « антисмысловые» олигонуклеотиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклестидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств.

508 ГЛАВА 21

Олигонуклеотиды, связывающиеся с белками: антитромбиновый аптамер

Блокировать экспрессию гена-мишени можно не только с помощью «антисмысловой» терапии, но и введением в клетку олигонуклеотида, связывающегося с фактором транскрипции или трансляции, однако этот подход пока недостаточно изучен. Далее, поскольку нуклеиновые кислоты способны связываться с белками, можно синтезировать такой олигонуклеотид (так называемый аптамер), который будет присоединяться к определенному белку, в норме не связанному ни с какими нуклеиновыми кислотами, и блокировать его функцию. Так, анти-тромбиновый аптамер может стать недорогим средством профилактики тромбообразования при различных хирургических вмешательствах.

Для его получения использовали набор химически синтезированных олигонуклеотидов, состоящих из 18-нуклеотидных фланкирующих областей (праймеров) и центрального 60-нуклеотидного участка, где в каждом из 60 положений может находиться любой из четырех нуклеотидов. Теоретически такой набор содержит примерно 1,3 · 10³⁶ (4⁶⁰) олигонуклеотидов с разной центральной последовательностью. Образец пропустили через колонку, содержащую связанные молекулы тромбина, присоединившиеся к тромбину олигонуклеотиды элюировали и повторно пропустили через колонку со связанным тромбином. Эту процедуру повторяли не менее трех раз. Конечный набор тромбиновых аптамеров амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали, после чего определили физические и биологические свойства каждого из них. Те аптамеры, которые обладали высокими сродством, специфичностью и антитромбиновой активностью, отбирали для более детального анализа.

Таким образом был получен эффективный антитромбиновый аптамер, К сожалению, вследствие малого времени жизни in vivo его можно использовать только для временного ингибирования функции тромбина (например, при кардиопульмонарном шунтировании), а в тех случаях, когда необходимо длительное введение противосвертывающих веществ (например, при ангиопластике), он неприменим. Очевидно, что описанную процедуру идентификации аптамеров можно использовать и в случае других белков-мишеней.

Рибозимы как лекарственные средства

Рибозимы — это природные РНК, обладающие каталитической активностью (РНК-ферменты); их субстратсвязывающий домен присоединяется к комплементарной РНК-мишени с помощью водородных и, возможно, других связей, а каталитический расщепляет ее в специфическом сайте. Модифицируя субстратсвязывающую последовательность, можно получить рибозим, специфичный в отношении определенной мРНК (рис. 21.15).

Создание «терапевтического» рибозима — сложный процесс. Связано это с трудностью получения больших количеств синтетических РНК и сохранения их в нативном состоянии в клетке-мишени. В одном из экспериментов синтезировали олигодезоксинуклеотид, который содержал каталитический домен (примерно 20 нуклеотидов), фланкированный гибридизующимися с мРНК-мишенью последовательностями (они же выступали в роли праймеров), амплифицировали его, встроили в эукариотический экспрессирующий вектор и трансфицировали полученной конструкцией клетки. Образовавшийся после транскрипции рибозим расщеплял мРНК-ми-

Рис. 21.15. Расщепление мРНК под действием рибозима. Рибозим, субстратсвязывающий домен которого модифицирован с помощью генной инженерии, гибридизуется с мРНК-мишенью и расщепляет ее в специфическом сайте (показано стрелкой). (Из работы Tone et al., In Vivo 7: 471—476, 1993, с изменениями.)

Генная терапия509

шень и подавлял трансляцию белка, ответственного за развитие того или иного заболевания. Рибозимы, созданные методами генной инженерии, можно использовать для лечения рака и вирусных инфекций.

Природных ДНК-ферментов (дезоксирибозимов) пока не обнаружено, но уже синтезированы олигодезоксинуклеотиды, обладающие каталитической активностью. Преимущество дезоксирибозимов состоит в том, что для их получения не нужно использовать экспрессирующий вектор: ДНК-ферменты можно упаковать в липосомы и доставить в клетку-мишень. Однако создание эффективных ДНК-ферментов находится пока на начальном этапе развития.

Коррекция генетических дефектов с помощью олигонуклеотидов

Многие генетические дефекты можно скорректировать, заменив связанную с данным дефектом пару нуклеотидов в мутантном гене на «правильную» пару. В одном из экспериментов для этой цели использовался 68-членный химерный (ДНК-РНК) олигонуклеотид, который образует шпильку с двумя головками и содержит метилированный кислород при 2'-углерод-ном атоме рибозы (рис. 21.16). Выбор такого необычного олигонуклеотида основывается на следующих экспериментальных данных: 1) ге-теродуплексы РНК-ДНК легче, чем двухцепочечные ДНК, спариваются с гомологичными нуклеиновыми последовательностями; 2) го-

ловки шпилек, не участвующие в спаривании, защищают олигонуклеотид от экзонуклеаз; 3) 2'-О-метилирование предотвращает разрушение молекулы РНКазой Н. Важно и расположение нуклеотидов в химерной молекуле: десять рибонуклеотидов фланкируют пять центральных дезоксирибонуклеотидов, причем этот сегмент имеет одинаковую с мишенью последовательность и содержит нормальную пару нуклеотидов.

Возможность коррекции мутаций с помощью химерных олигонуклеотидов изучали с использованием как кДНК, входящей в состав плазмиды, так и хромосомной ДНК. В обоих случаях мутантный сайт с высокой частотой заменялся нормальным. Но для того чтобы химерные олигонуклеотиды стали эффективными лекарственными средствами, необходимы дополнительные исследования.

Если мутация в интроне распознается системой процессинга РНК как аутентичный сайт сплайсинга, то в процессированную мРНК включается часть интрона (рис. 21.17, А). Это приводит к сдвигу рамки считывания и образованию укороченного белка. При этом количество нормального белка снижается, что может стать причиной заболевания. Разумно предположить, что если «антисмысловой» олигонуклеотид, комплементарный мутантному интрону, гибридизуется с ним, то ошибочный сплайсинг блокируется, что повысит вероятность сплайсинга в нормальном сайте. Это предположение проверили на ß-глобиновом гене с мутацией во

Рис. 21.16. Исправление генетического дефекта, состоящего в замене одной пары нуклеотидов, с помощью химерного олигонуклеотида. Стрелкой указаны мутантный сайт в последовательности-мишени и нормальная пара оснований в химерном олигонуклеотиде. Соответствующие нуклеотиды подчеркнуты. Прописными буквами обозначены дезоксирибонуклеотиды, а строчными — рибонуклеотиды. Жирным шрифтом выделены нуклеотиды, образующие головки шпильки. Вертикальная черта указывает 3'- и 5'-концы химерного олигонуклеотида. (Из работы Yoon et al.T Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 2071 -2076, 1996, с изменениями.)

510 ГЛАВА 21

Рис. 21,17. Коррекция дефекта, приводящего к ошибочному сплайсингу, с помошью «антисмыслового» олигонуклеотида, А. Результат мутации, приводящей к ошибочному сплайсингу. Обозначения: цифры — экзоны, А -первый интрон, Б — второй интрон, содержащий мутацию (красный кружок), разделяющую его на две части (Б 1 и Б2). Штриховые линии охватывают сегменты РНК, вырезаемые при процессинге. Возможны два варианта сплайсинга: вариант а приводит к образованию функциональной мРНК, вариант 6 — к образованию РНК, включающей часть второго интрона (Б2). Б. «Антисмысловой» олигонуклеотид (АС), связывающийся с мутантным сайтом сплайсинга, препятствует его распознаванию при процессинге, ив результате образуется только функциональная мРНК.

втором интроне (рис. 21.17, Б), обусловливающей одну из форм ß-талассемии, наследственного заболевания крови, которое приводит к разрушению эритроцитов (анемии). В клетки, гомозиготные по мутантному гену (1VS2-654), ввели содержащий тиофосфатные связи «антисмысловой» 2'-О-метилолигонуклеотид, комплементарный мутантному сайту сплайсинга. В результате число нормальных ß-глобиновых цепей увеличилось на 50%. Дальнейшие исследования покажут, является ли этот подход достаточно эффективным для лечения талассемии и других состояний, вызванных подобными мутациями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для многих наследственных заболеваний никаких достаточно эффективных способов лечения не существует, и во многом это связано с трудностями получения и адресной доставки соответствующего генного продукта. После разработки методов идентификации и клонирования нормальных вариантов дефектных генов (часто в виде кДНК) были предприняты попытки использовать их для коррекции генетических дефектов. Для лечения заболеваний на молекулярном уровне применяются два основных подхода: генная терапия ex vivo и генная терапия in vivo.

При генной терапии ex vivo «терапевтический» ген переносят в изолированные клетки больного с помощью ретровирусных векторов или других систем доставки, трансдуцированные клетки культивируют и вводят пациенту. При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой. Альтернативный способ генной терапии ех vivo использует генноинженерную модификацию неаутологичных клеток, заключенных в мембрану, которая предотвращает развитие нежелательного ответа и не препятствует высвобождению «терапевтического» генного продукта.

При генной терапии in vivo «терапевтический» ген вводят непосредственно в клетки ткани-мишени больного. Для этого разработаны разные системы доставки: вирусные (ретрови-

Генная терапия 511

русные, аденовирусные, аденоассоциированные векторы и векторы на основе вируса простого герпеса) и невирусные (инъекция чистой ДНК, бомбардировка ткани-мишени частицами, конъюгированными с ДНК, захват клетками ДНК, заключенной в липидную оболочку). Кроме того, разработаны вирусные и невирусные системы доставки генов, специфичные для определенных клеток.

Весьма перспективным способом разрушения быстроделящихся раковых клеток представляется генная активация лекарственного вещества. При этом наиболее широко используется подход, включающий последовательное введение в опухолевые клетки гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и ганциклови-ра. В результате образуется ганцикловиртрифосфат, токсичный для быстроделящихся клеток. Погибают и нетрансформированные клетки, контактирующие с HSVtk-модифицированными клетками («эффект свидетеля»).

В качестве лекарственных средств можно использовать не только генные продукты, но и олигонуклеотиды. С помощью так называемых «антисмысловых» олигонуклеотидов можно подавить полностью или частично экспрессию гена того или иного наследственного заболевания. В одном из вариантов такой терапии клонированный ген встраивают в экспрессирующий вектор в обратной ориентации, в результате чего образуется комплементарный нормальной мРНК ДНК-транскрипт, который спаривается с ней и ингибирует трансляцию. В более распространенном варианте введенный в клетку-мишень «антисмысловой» олигонуклеотид гибридизуется со специфической мРНК и блокирует ее трансляцию. Эффективность «антисмысловых» олигонуклеотидов и время их жизни повышаются в результате модификаций, затрагивающих фосфодиэфирную связь, пиримилины и остатки Сахаров. В настоящее время изучается терапевтическое действие различных олигонуклеотидов: модифицированных с помощью генной инженерии рибозимов, расщепляющих специфические мРНК; аптамеров, которые связываются со специфическими белками и блокируют их функции; олигонуклеотидов, с помощью которых можно корректировать замену одной нуклеотидной пары и мутации, приводящие к неправильному сплайсингу.

ЛИТЕРАТУРА

Agrawal S. (ed.) 1996. Anlisense Therapeutics.

Humana Press Inc., Totowa, N. J. Altmail S.1993. RN A enzyme-directed gene therapy.

Proc. Nat/. Acad. Sei. USA 90: 10898-10900. Anderson W. F.1992. Human gene therapy. Science

256: 808-813. Blaese R. M., K. W. Culver, A. D. Miller,

C. S. Carter, T. Fleisher, M. Clerici, G. Shearer, L. Chang, Y. Chiang, P.Tolstnshcv, J. J. GreenMatt,S. A. Rosenberg, 11. Klein, M. Berger, С. A. Mullen, W. J. Ramsey, L. Muul, R.A. Morgan, W. F. Anderson. 1995. Т lymphocyte-directed gene therapy for ADA" SCID: initial trial results after 4 years. Science 27«: 475- 480.

Bordignon C., L. D.Nntarangelo, N. Nobili,(т. Ferrari, G. Casorati, I¹. Panina, F. Mazznlari,

D. Maggioni, C. Rossi, P.Servida, A. G. Lgazio, F. Mavilio. 1995. Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA immunodeficient patients. Science 270:470—475.

Breaker R. R.1997. DNA enzymes. Nat. Biatechnol 15:427-431.

Burfeind P., C. L. Chernicky, F. Rininsland, J. Han, J. Han.1996. Antisense RNA to the type I insulin-like growth factor receptor suppresses tumor growth and prevents invasion by rat prostate cancer cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7263-7268.

CaplenN. J., E. W. F. W.Alton, P. G. Middlelnn, J. R. Dorin, B. J. Stevenson, X. Gao, S. R. Durham, K. Jeffery, M. F. Hndson, C. Coutelle, L. Huang, D. J. Porteus, R. Williamson, D. M. Geddes.1995. Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibro&ih. Nat. Med. 1: 39-46.

Cole-Strauss A., K. Yoon, Y.Xiang, B. C. Bryne, M. C. Rice, J. Gryn, W. K.Hollouian, E. B. Kmiec. 1996. Correction of the mutation responsible for sickle cell anemia by an RNA-DNA oligonu-cleotide. Science 273: 1386-1389.

Cornetta K., R. A. Morgan, W.F. Anderson.1991. Safety issues related to retroviral-mediated gene transfer in humans. Hum. Gerte Ther. 2: 5—14.

Crystal R. G. 1995. Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success. Science 270: 404-410.

512 ГЛАВА 21

Culver K. W., F. W. Anderson, R. M. Blaese.1991. Lymphocyte gene therapy. Hum. Gene Ther. 2i 107-109.

Culver K. W., Z. Ram, S. Wallbridge, H. Ishii, E. H. Oldficld, R. M. Blaese.1992. In vivotrans-ver with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256: 1550-1552.

Ellington A. D., R. Conrad.1995. Aptamers as potential nucleic acid pharmaceutical«. Biotechnol. Annu. Rev. 1: 185-214.

Emerich D. F., S. R. Winn, P. M. Hantraye, M. Peschanski, E.-Y. Chen, Y. Chu, P.M с Demon, E. E. Baetge, J. H. Kordower.l'J'J?. Protective effect of encapsulated cells producing neurotrophic factor CNTF in a monkey model of Huntington's disease. Nature 386: 3^[J5-3^[J^[J.

Fender P., R. W. H. Ruigrok, E. Gout, S. Buffet, J. Chroboczek.1997. Adenovirus dodecahedron, a new vector for human gene transfer. Nat. Biotechnol. 15:52-56.

flotte T. R., В. J. Carter.1995. Adeno-associated virus vectors for gene therapy. Gene Ther. 2: 357-362.

Grossman M.,S. E.Kaper, K. Kozarsky, E. A. Stein, J. F.Engelhardt, D. Muller, P. J. Lupien, J. M. Wilson.1994. Successful ex vivo gene therapy directed to liver in a patient with familial hypercholesterolaemia. Net. Genet. 6: 335-341.

Harrington J. J.,G. V.Bnkkelen, R. W. Mays, K. Gustashaw, H.F. Willard. 1997. Formation of de novo centromeres and construction of first-generation human artificial microchromosomes. Nat. Genet. 15:345-355.

Ishii-Morita H., R. Agbaria, C.A. Mullen, H.Hirano, D. A. Koeplin, 7.Kam, E. H. OMfieW, D. G. Johns, R. M. Blaese.1997. Mechanism of 'bystander effect' killing in the herpes simplex thymidine kinase gene therapy model of cancer treatment. Gene Ther. 4: 244-251.

JiaoS., P.Williams, R. K. Berg. B. A.Hodgeman, L. Liu, G. Repetto, J. A. Wolff.1992. Direct gene transfer into nonhuman primate myofibres in vivo. Hum. Gene Ther. 3: 21-33.

Kochanek S., P. R. Clemens, K. Mitani, H.-H. Chen,S. Chan, C. T. Caskey.1996. A new adenoviral vector: replacement of all viral coding sequences

with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and ß-galactosidase. Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93:5731-5736.

Koeberl D. D., I. E.Alexander, C. L. Haibert, D. W. Russell, A. D. Miller.1997. Persistent expression of human clotting factor IX from mouse liver after intravenous injection of adeno-associated virus vectors. Proc. Natl. Acad. Sei. VSA94: 1426-1431.

Lanza R. P., J. L. Hayes, W. L. Chick.1996. Encapsulated cell technology. Nat. Biotechnol. 14:1107-1111.

Leib D.A., P. D. Olivo.1993. Gene delivery to neurons: is herpes simplex virus the right tool for the job? BioEssays 15:547-554.

Lewis J. G., K.-Y. Lin,A. Knthavale, W.M. Flangan, M. D.Matteucci, R. B. De Prince, R. A. Mook, Jr., R. W. Hendren, R. W. Wagner.1996. A serum-resistant cytofectin for cellular delivery of antisense oligodeoxynucleotides and plasmid DNA. Proc. Nati. Acad. Sei. USA 93: 3176-3181.

Lyon J-, P. Corner.1995. Altered Fates: Gene Therapy and the Retooling of Human Life. W. W. Norton & Company, Inc., New York, N.Y.

Michael S. L, D. T. Curiel.1994. Strategies to achieve targeted gene delivery via the receptor-mediated endocytosis pathway. Gene Ther. 1: 223-232.

MillerA. D.1992. Human gene therapy comes of age. Nature 357: 455-460.

Mulligan R. C. 1993. The basic science of gene therapy. Science 260:926-932.

Pochon N. A.-M., B. Heyd,N. Déglon, J.-M. Joseph, A. D. Zürn, E. E. Baetge, J. P.Hamming, M. Goddard, M. Lysaght, F.Kaplan, A. C. Kato, M. Schluep, L. Hirt, F. Regli, F. Porchet, N. De Tribolet.1996. Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) using a polymer encapsulated xenogenic cell line engineered to secrete hCNTF, Hum. Gene Ther. 7: 851-860.

Putnam D. A. 1996. Antisense strategies and therapeutic applications. Am. J. Health-Syst. Pharm. 53: 151-160.

Santoro S. W., G. F. Joyce.1997. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94: 4262-4266.

Генная терапия 513

Sierakowska H., M. J. Sambade, S. Agrawal, R. Kole* 1996. Repair of thalassemic human-ß-globin mRNA in mammalian cells by antisense oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 12840-12844.

Sun W. H., J. K. Burkholder, J. Sun, J. Culp, J. Turner, X. G. Lu, T. D. Pugh, W. B. Ershler, N.-S. Yang. 1995. In vivo cytokine gene transfer by gene gun reduces tumor growth in mice. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 2889-2893.

Tone T., M. Kashani-Sabet, T. Funato, T. Shitara, E. Yoshida, В. I. Kashfian, M. Horng, O. Fodstadt, K. J. Scanion. 1993. Suppression of EJ cells tumorigenicity. In Vivo 7:471—476.

Trojan J., B. K. Blosscy, T. R. Johnson, S. D. Rudin, M. Tjkocinski, J. Dan, J. Dan. 1992. Loss of tumorigenicity of rat glioblastoma directed by episome-based antisense cDNA transcription of insulin-like growth factor 1. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 4874-4878.

Wagner R. W. 1994. Gene inhibition using antisense oligodeoxynucleotides. Nature 372: 333—335.

Yoon K., A. Cole-Strauss, Б. B. Kmiec. 1996. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNA-DNA oligonucleotide. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:2071-2076.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Что такое генная терапия ex vivo?

2. Опишите использование неаутологичных клеток, модифицированных с помощью генной инженерии, для генной терапии ex vivo. Почему этот подход представляется весьма перспективным?

3. Что такое генная терапия in vivo?

4. Опишите подробно по крайней мере две вирусные системы адресной доставки генов.

5. Опишите подробно по крайней мере три невирусные системы доставки генов.

6. Что такое терапия с использованием «антисмысловых» олигонуклеотидов?

7. С помощью каких модификаций можно увеличить время жизни и повысить эффективность «антисмысловых» олигонуклеотидов как лекарственных средств?

8. Опишите способ лечения злокачественных новообразований с помощью гена HSVtk.

9. Как нужно модифицировать рибозим, чтобы его можно было использовать в качестве лекарственного средства?

10. Как выделяют «терапевтический» аптамер? В чем преимущества аптамеров перед другими видами лекарственных средств?

ЧАСТЬ IV.
Контроль исследований в области молекулярной биотехнологии и патентование биотехнологических изобретений

Все революционные технологии так или иначе влияют на развитие общества. С их появлением возникают разные проблемы экономические, социальные, этические; все они обусловливаются внедрением в практику новых подходов, вытесняющих традиционные методы. Молекулярная биологии не является исключением. Более того, имея дело с живыми организмами, она затрагивает действительно жизненно важные, давно сформировавшиеся устои, будоража общество. Возникают вопросы о правомерности использования новых биотехнологических подходов и о том, как обеспечить их контролируемое и безопасное внедрение. В ч. IV мы проанализируем некоторые социально значимые аспекты развития и применения методов молекулярной биотехнологии, в частности вопросы контроля исследований в

области рекомбинантных ДНК, производства генетически модифицированных пищевых продуктов, деятельности служб по контролю за распространением трансгенных организмов в окружающей среде, санкционирования разработок и практического применения методов генной терапии, а также проблемы патентования биотехнологических изобретений.

ГЛАВА 22.
Контроль применения биотехнологических методов

Внедрение революционных технологий, в том числе и молекулярной биотехнологии, всегда сопровождается повышенным вниманием со стороны общественности. Для одних новые технологии — это предвестник неминуемых катастроф, подрывающих самые основы общества. Такие люди полагают, что любые новшества неизбежно таят в себе опасность, и избежать ее можно, только прекратив всякие разработки. Другие смотрят на новые технологии как на рог изобилия, из которого на человечество посыплются несказанные блага, и считают, что любые препятствия на пути их развития лишают общество неоценимых преимуществ. Они полагают, что новая технология слишком «хрупкая» вещь и нуждается в защите, чтобы она могла принести ожидаемые плоды. Третья группа людей придерживается промежуточной точки зрения. Ее представители считают, что ничего принципиально нового вообще не существует и любая «новая» технология — это развитие старой. Таких людей вполне устраивают существующие методы контроля, уменьшающие риск, а эффект от новой технологии неизбежно наступит, как только она встанет на ноги.

Поскольку молекулярная биотехнология может оказать влияние на самые разные стороны жизни современного общества, в том числе на сельское хозяйство и медицину, необходимо учитывать все возникающие при этом проблемы - этические, правовые, экономические и социальные. Еще в 1973 г. были высказаны серьезные сомнения по поводу безопасности технологии рекомбинант-ных ДНК. Ученым пришлось даже наложить мораторий на некоторые исследования в этой области до принятия официальных правил работы с рекомбинантными микроорганизмами. Согласно этим правилам, эксперименты можно было проводить только с теми из них, которые неспособны размножаться вне лаборатории, а сами исследователи должны были быть защищены от какой бы то ни было опасности. Правила разрабатывались в 1974—1975 гг. в ходе открытых дебатов и под пристальным вниманием прессы, так что общественность получила полное представление о последствиях — как негативных, так и позитивных — генетического манипулирования с живыми организмами. Тем не менее в конце 1970-х гг. все еще высказывались сомнения в безопасности работ с рекомбинантными ДНК. В частности, существовало мнение, что попадание генетически модифицированных организмов в окружающую среду может привести к неконтролируемому распространению их в экосистемах. Пришлось ввести дополнительные нормы, уменьшающие и без того небольшую вероятность событий такого рода.

Развернулась широкая дискуссия и по поводу этичности проведения генетических экспериментов на человеке. Цель ее заключалась в том, чтобы попытаться разграничить то, что совершенно недопустимо, и то, что вполне приемлемо. К сожалению, нельзя дать однозначного ответа на все этические, правовые и социальные вопросы, возникающие в связи с разнообразными применениями молекулярной биотехнологии. Однако ставки в игре чрезвычайно высоки, поэтому детальный анализ проблем необходим.

518 ГЛАВА 22

Контроль экспериментов с рекомбинантными ДНК

В 1974 г., когда стало ясно, что с помощью технологии рекомбинантных ДНК можно создавать организмы, несущие чужеродные гены, ученые, общественность и официальные лица забили тревогу по поводу безопасности этого нового подхода и возможных этических последствий его применения. Такие выражения, как «заигрывание с Богом», «манипулирование жизнью», «самые опасные из проводившихся когда-либо научных исследований», «творимая человеком эволюция» без конца мелькали в прессе, Больше всего тревожило то, что случайно, а возможно, и намеренно, в военных целях, будут созданы уникальные, ранее не существовавшие в природе микроорганизмы, которые станут причиной эпидемий или экологических катастроф. В ответ на эти панические ожидания группа ведущих молекулярных биологов предложила наложить мораторий на некоторые эксперименты с рекомбинантными ДНК, особенно на те, в которых используются патогенные микроорганизмы.

В 1976 г. Национальные институты здравоохранения (NIFU от National Institutes of Health), ведущее исследовательское ведомство США, выделяющее денежные средства на работы в области медицины и здравоохранения, разработали директиву, регламентирующую проведение всех субсидируемых ими экспериментов с рекомбинантными ДНК. В ней жестко оговаривались условия работы с рекомбинантными ДНК в лаборатории и выдвигалось требование, чтобы в качестве хозяев для чужеродных ДНК использовались только микроорганизмы, неспособные размножаться вне стен лаборатории и передавать свою ДНК другим микроорганизмам. Для экспериментов с известными патогенными организмами, например, было рекомендовано использовать специально сконструированные, находящиеся под постоянным контролем изолированные боксы, в которых поддерживается отрицательное давление, и работы с менее опасными организмами можно было проводить в помещениях, оборудованных высокоэффективными системами фильтрации. Несмотря на то что директивы NIH не имели правового статуса, большинство компаний, приступающих к работам с применением технологии рекомбинантных ДНК, добровольно выполняли все указанные требования. Более того, другие страны, принимая директивы NIH за основу, разработали собственные ограничения для экспериментов с рекомбинантными ДНК.

Исходные директивы NIH были очень жесткими, и многие ученые считали, что их требования избыточны. Например, стоимость необходимого оборудования, обеспечивающего соблюдения всех оговоренных мер биологической безопасности, была столь высока, что небольшие компании и исследовательские группы были вынуждены отказываться от работ с рекомбинантными ДНК. Для возможного пересмотра этих директив был создан Консультативный комитет NIH по рекомбинантным ДНК (NIH Recombinant DNA Advisory Committee, NIH-RAC). Он должен был контролировать исследования, связанные с рекомбинантными ДНК, и при необходимости изменять действующие правила. В его обязанности входили также организация открытых дискуссий по обсуждению принимаемых решений, информирование о планируемых заседаниях, согласование времени их проведения. Необходимо было организовать работу так, чтобы любые лица, не члены Комитета, могли обращаться в него по всем входящим в его компетенцию вопросам. Большинство членов Комитета составляли ученые, но в него входили также специалисты по вопросам этики и представители общественности.

В соответствии с первоначальными директивами NIH, к категории экспериментов, «которые не могли проводиться в настоящее время» ни при каких условиях, относились такие, которые были связаны с «преднамеренным высвобождением в окружающую среду любых организмов, содержащих рекомбинантную ДНК». Однако само создание генетически модифицированных организмов (ГМО), способных выживать в природных экосистемах, было неизбежным.

К 1980 г. первоначальные директивы NIH были пересмотрены в сторону смягчения требований, в основном благодаря экспериментальным данным, полученным в ходе исследований, финансированных NIH-RAC и NIH. Например, было установлено, что микроорганизм Escherichia

Контроль применения биотехнологических методов 519

coli K-12, чаше других использовавшийся в работах с рекомбинантными ДНК, не способен размножаться и длительное время существовать вне стен лаборатории. Кроме того, микробиологи убедили молекулярных биологов и других заинтересованных лиц в том, что те меры безопасности, которые принимаются при работе с патогенными организмами, соответствуют самым высоким стандартам и более жесткие нормы не требуются. И наконец, было признано чрезвычайно маловероятным появление патогенного организма, если используемый для клонирования ген не «отвечает» за патогенные свойства того организма, из которого он был выделен. По мнению большинства, при должном оснащении лабораторий можно обеспечить безопасность работающего персонала. Однако к директивам NIH были добавлены специальные правила по обеспечению мер предосторожности, исключающих случайный выброс в окружающую среду генетически модифицированных организмов при их крупномасштабном культивировании.

После того как требования к мерам безопасности для большинства рутинных экспериментов были смягчены, технология рекомбинантных ДНК стала быстро развиваться. Разработанные NIH-RAC и NIH правила частично сняли существовавшие ранее опасения. Однако остались две важных проблемы. Во-первых, как контролировать производство и потребление пищевых продуктов, содержащих генетически измененные организмы или полученных с их использованием? Во-вторых, как уследить за преднамеренным высвобождением ГМО в окружающую среду?

Третью возможную проблему удалось разрешить, когда контролирующие органы пришли к выводу, что лекарственные препараты, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, аналогичны препаратам, полученным традиционными методами. В большинстве стран существует четкая установка, что действующих норм, которые регламентируют коммерческое использование лекарственных препаратов, достаточно для того, чтобы обезопасить как производителей, так и потребителя, независимо от способа получения препарата (традиционная технология или технология рекомбинантных

ДНК). Положение, согласно которому проверке на безопасность и эффективность должен подвергаться только сам продукт, привело к одобрению лекарственых средств, вакцин, диагностических систем и других продуктов, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК.

Контроль за производством и потреблением пищевых продуктов и пищевых добавок

В США контроль за производством и поступлением на рынок пищевых продуктов, лекарственных и медицинских средств осуществляет Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (FDA, от англ. Food and Drug Administration). Безопасность пищевых продуктов и пищевых ингредиентов, в том числе добавок, придающих продуктам специфический вкус и запах, должна быть гарантирована еще до получения лицензии, разрешающей их введение в товарооборот и подтверждающей, что такие продукты можно употреблять в пищу. FDA в своей деятельности руководствуется многократно апробированной, но не в полной мере узаконенной системой сертификации новых пищевых продуктов и пищевых компонентов. Ее недоброжелатели отмечают, что эта организация старается соблюсти интересы промышленных предприятий и не слишком торопится ввести в действие свои собственные нормативные акты. Как FDA, так и производители пищевых продуктов, чьи интересы представляет Международный совет по пищевой биотехнологии, отстаивают (в чем-то весьма убедительно) ту точку зрения, что нет никакой необходимости в разработке новых нормативных актов, регулирующих производство и потребление пищевых продуктов и пищевых компонентов, получаемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, поскольку любой нелицензированный пищевой продукт или пищевой ингредиент (независимо от способа его получения) и так должен пройти проверку на токсичность, чистоту и аллергенность. Если в результате генетических манипуляций (например, связанных с процедурой селекции или использованием самой технологии рекомбинантных ДНК) состав утвержденных

520 ГЛАВА 22

FDA пищевых продуктов или пищевых ингредиентов изменяется, то компания-производитель, проверив такие продукты на безопасность, должна снабдить их специальным ярлыком, уведомляющим о том, что новый продукт отличается от традиционного.

Химозин

Новые пищевые продукты обычно подвергаются многочисленным проверкам. Однако, чтобы упростить процедуру тестирования и снизить себестоимость продукта, при лицензировании учитывается сходство нового продукта с известным, который и предполагается заменить на рынке. Например, FDA утвердила к применению фермент химозин, полученный с помощью технологии рекомбинантных ДНК и предназначенный для производства сыров, хотя соответствующие испытания не были проведены в полном объеме. Химозин, один из ключевых ферментов сычуга жвачных животных, является сбраживающим молоко протеолитическим ферментом, который гидролизует к-казеин. В результате такого гидролиза в молоке образуется сгусток, который в свою очередь ферментируется с образованием сыра. Обычно сбраживающий молоко агент, используемый при производстве сыра, получают из четвертого отдела желудка жвачных животных (сычуга); он представляет собой смесь веществ, известных под общим названием «сычужный фермент».

Чтобы обеспечить надежный, удобный и по возможности наиболее дешевый промышленный способ получения химозина, кодирующий его ген клонировали и экспрессировали в Е. coli К-12. Готовый продукт был выделен из бактериальных клеток, и в FDA направлена просьба дать разрешение на коммерческое использование рекомбинантного химозина для промышленного производства сыров. Перед FDA встал вопрос: какие критерии использовать в этом случае? Поскольку применение сычужного фермента, содержащего химозин, в сыроваренной промышленности имеет долгую историю, FDA резонно заключила, что если рекомбинантный химозин идентичен природному ферменту, то дополнительное тестирование проводить не обязательно. По существу лицо, запрашивающее разрешение, должно было лишь подтвердить, что рекомбинантный химозин аналогичен сычужному ферменту. Идентичность клонированного и природного генов химозина была подтверждена рестрикционным картированием, ДНК-гибридизацией и секвенированием ДНК. Более того, было показано, что рекомбинантный химозин обладал такой же молекулярной массой, что и природный очищенный химозин теленка, и одинаковой с ним биологической активностью.

Далее, необходимо было показать, что рекомбинантный химозин безопасен для применения. Компания представила данные, подтверждающие, что конечный препарат, экстрагированный из бактериальных телец включения и прошедший все необходимые этапы очистки, не загрязнен целыми бактериальными клетками, клеточным дебрисом и другими примесями, в том числе нуклеиновыми кислотами. Кроме того, многочисленные исследования показали, что штамм E. coli K-12 нетоксичен и непатогенен для человека. Результаты тестирования на животных не выявили никаких побочных эффектов препарата, что свидетельствовало об отсутствии в нем токсинов. После изучения всей полученной информации FDA пришла к выводу, что рекомбинантный химозин может быть разрешен для коммерческого использования.

Триптофан

Организации, занимающиеся контролем производства и поступления на рынок пищевых продуктов и пищевых ингредиентов, полученных с помощью технологии рекомбинантных ДНК, часто руководствуются в своей работе так называемым прецедентным правом (case-by-case law). В каждом случае вопрос рассматривается отдельно, и в зависимости от решения официального органа проводятся те или иные тесты на безопасность продукта. Производители предпочитают (и оказывают давление на правительство), чтобы соответствующие государственные органы разработали универсальный набор тестов для всех продуктов, полученных методами генной инженерии, однако такая инициатива не находит поддержки. Включение пищевых продуктов, полученных на основе технологии рекомбинантных ДНК, в число това-

Контроль применения биотехнологических методов 521

ров, разрешенных к употреблению, проходит чрезвычайно осторожно, прежде всего потому, что неправильные выводы, изначально кажущиеся правомерными, впоследствии могут привести к неожиданным и даже трагическим последствиям.

В течение 1989—1990 гг. в США отмечалось резкое увеличение встречаемости синдрома эозинофилии—миалгии (СЭМ). Это в общем-то редкое заболевание характеризуется тяжелыми, изнурительными мышечными болями и может закончиться смертью больного в результате спазма дыхательных путей. Большинство пациентов с СЭМ употребляли в качестве пищевой добавки аминокислоту триптофан, причем в больших количествах. Каждый раз, когда пытались установить происхождение триптофана, выходили на одну и ту же химическую компанию. Обнаружившаяся корреляция между потреблением триптофана и развитием СЭМ обескураживала, поскольку до этого не было обнаружено никаких негативных последствий применения триптофана в качестве пищевой добавки. В ходе дальнейших изысканий обнаружилось, что все партии «некачественного» триптофана были получены с помощью штамма генетически трансформированных бактерий, специально сконструированного для того, чтобы обеспечить сверхпродукцию триптофана. Компания сочла, что этот штамм идентичен предыдущему и поэтому не стала проводить дополнительные тесты на безопасность продукта. В то же время одна из стадий очистки триптофана, как считалось — несущественная, изменилась, хотя все контрольные тесты на качество очистки конечного продукта остались прежними.

Как показали результаты химического анализа коммерческих продуктов, полученных с помощью генетически модифицированного штамма, эти продукты содержат метаболиты триптофана, в том числе 1-1'-этилен-бис[триптофан] (ЭБТ). Вначале образование ЭБТ было связано с нарушением метаболизма триптофана у нового штамма. Параллельно основным исследованиям, целью которых было установить, способен ли ЭБТ вызывать СЭМ, проводились другие эксперименты, в ходе которых выяснилось, что ЭБТ продуцируют и штаммы дикого типа. Анализ на токсичность выявил способность ЭБТ вызывать патологические изменения у крыс, сходные с симптомами СЭМ, а также -что было совсем неожиданно — способность самого триптофана, хотя и в меньшей степени, вызывать некоторые симптомы СЭМ. Как следствие L-триптофан, даже не содержащий никаких примесей, был запрещен в США для употребления человеком. С чем было связано появление ЭБТ в составе прежде безопасного продукта, так и осталось неясным. Большинство сошлось во мнении, что причиной было изменение в методе очистки. Возможно, при «старом» способе очистки ЭБТ эффективно удалялся, хотя компания об этом не подозревала.

Один из уроков, который можно извлечь из этой истории, заключается в том, что хотя генетическая инженерия может оказаться и ни при чем, биологическая идентичность между исходным штаммом и его генетически модифицированным двойником не должна упускаться из виду. Это относится как к штаммам, полученным традиционными способами, так и к штаммам, полученным генноинженерными методами. Более того, производители теперь осознают, что даже несущественные технические изменения в способе очистки могут привести к изменению свойств продукта. Другое дело — что они дальше предпринимают. Многие компании не хотят подвергать всестороннему исследованию на токсичность те продукты, которые, как они считают, уже были тщательно проверены. Однако большинство производителей придерживаются мнения, что, несмотря на издержки, «лучше безопасность, чем неприятности».

Бычий соматотропин

Безопасность продуктов, полученных с помощью новых технологий, — это только одна из тех проблем, которые возникают перед обществом в связи с появлением таких технологий. Примером эффективной и безопасной инновации, не принятой, однако, обществом с распростертыми объятиями, может служить получение рекомбинантного бычьего соматотропина (БСТ), известного также под названием гормона роста крупного рогатого скота.

В 1930-х гг. было показано, что введение БСТ коровам в значительной степени повышает их