МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

Зав. редакцией канд. биол. наук М. Р. Погосбекова

Ведущий редактор Н. Н. Шафрановская

Редактор Р. Ф. Куликова

Художник Н. В. Зотова

Технический редактор Е. В. Денюкова

Корректор Р. Ф. Куликова

Оригинал-макет подготовлен Л. К. Васильевой График-дизайнеρ С. В. Машин Оператор Н. Е. Кизилова

Лицензия ЛР № 010174 от 20.05.97 г.

Подписано к печати 10.09,01. Формат 84 χ 108^ι/κ>. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура NewionC. О&ьем 18,50 бум, л. Усл. печ. л. 62.16. Уч.-изд я. 62,07. Изд. № 4/9698. Тираж 5000 экз. Зак. 5185.

Издательство «Мир» Министерства РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовых коммуникации 107996, ГСП-6, Москва, 1-Й рижский пер,, 2.

Диапозитивы изготовлены в издательстве «Мир»

Отпечатано в полном соответствии

С качеством предоставленных диапозитивов

в ОАО «Можайский полиграфический комбинат»,

143200, г. Можайск, ул. Мира, 93

ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ

От редактора перевода. 5

Предисловие. 7

Предисловие к первому изданию.. 9

Благодарности.. 10

Часть I. Основы молекулярной биотехнологии. 13

ГЛАВА 1. Молекулярно-биотехнологическая революция. 15

Технология рекомбинантных ДНК.. 15

Возникновение молекулярной биотехнологии.. 16

Коммерциализация молекулярной биотехнологии.. 19

Надежды и опасения. 20

Создание функциональных бактериальных плазмид in vitro. 21

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 22

ЛИТЕРАТУРА.. 23

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 23

ГЛАВА 2. Биологические системы, использующиеся в молекулярной биотехнологии. 24

Прокариоты и эукариоты.. 24

Escherichia coli 24

Появление новых генотипов в смешанной культуре биохимических мутантов бактерий.. 26

Saccharomyces cerevisiae. 27

Культуры эукариотических клеток.. 27

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 28

ЛИТЕРАТУРА.. 28

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 28

ГЛАВА 3. ДНК, РНК и синтез белка. 29

Структура ДНК.. 29

Репликация. 32

Расшифровка генетической информации: РНК и белок.. 33

Трансляция. 38

Регуляция транскрипции у бактерий.. 41

Структура дезоксирибонуклеиновой кислоты.. 45

Регуляция транскрипции у эукариот. 45

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 47

ЛИТЕРАТУРА.. 49

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 49

ГЛАВА 4. Технология рекомбинантных ДНК.. 50

Рестрицирующие эндонуклеазы.. 50

ДОПОЛНЕНИЕ 4.1. 54

Гель-электрофорез. 54

Плазмидные векторы.. 56

Плазмидный вектор pBR322. 58

Трансформация и отбор. 58

Другие плазмидные векторы.. 60

При расщеплении ДНК рестриктазой RT образуются фрагменты с липкими концами.. 61

Скрининг с помощью гибридизации. 64

ДОПОЛНЕНИЕ 4.2. 65

Радиоавтография. 65

Иммунологический скрининг. 67

Скрининг по активности белка. 69

Клонирование структурных генов эукариот. 70

Векторы для клонирования крупных фрагментов ДНК.. 71

Векторы на основе бактериофага λ. 71

Космиды.. 74

Векторные системы для клонирования очень крупных фрагментов ДНК.. 76

Генетическая трансформация прокариот. 76

Перенос ДНК в E. coli 76

Электропорация. 76

Конъюгация. 77

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 78

ЛИТЕРАТУРА.. 78

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 79

ГЛАВА 5 Химический синтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК 80

Химический синтез ДНК.. 80

Фосфорамидитный метод. 80

Применение синтезированных олигонуклеотидов. 85

Синтез генов. 86

Методы секвенирования ДНК.. 88

Секвенирование ДНК с помощью терминирующих дидезоксинуклеотидов. 89

Специфическая ферментативная амплификация ДНК in vitro: полимеразная цепная реакция 89

Дидезоксинуклеотидный метод секвенирования ДНК.. 89

Секвенирование ДНК с помощью вектора на основе фага M13. 91

Праймер-опосредованная прогулка («Блуждающая затравка») 93

Полимеразная цепная реакция. 94

Получение с помощью ПЦР кДНК, отвечающих концам молекул мРНК.. 98

Синтез генов с помощью ПЦР. 102

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 102

ЛИТЕРАТУРА.. 103

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 104

ГЛАВА 6. Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах 105

Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов. 105

Регулируемые промоторы.. 107

Получение больших количеств белковых продуктов. 108

Крупномасштабные системы.. 109

Использование для экспрессии других микроорганизмов. 111

Химерные белки.. 112

Расщепление химерных белков. 112

Применение химерных белков. 113

Включение белков в поверхностные структуры.. 115

Однонаправленное тандемное расположение генов. 117

Трансляционные экспрессирующие векторы.. 118

tac- Промотор: функциональный гибрид, полученный из trp- и lac- промоторов. 120

Стабилизация белков. 121

Рост в условиях недостатка кислорода. 122

Применение хозяйских штаммов с дефицитом протеиназ. 122

Бактериальный «гемоглобин». 122

Интеграция чужеродной ДНК в хромосому хозяина. 123

Повышение эффективности секреции.. 126

Метаболическая перегрузка. 127

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 130

ЛИТЕРАТУРА.. 131

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 133

ГЛАВА 7 Получение рекомбинантных белков с помощью эукариотических систем.. 135

Системы экспрессии Saccharomyces cerevisiae. 136

Векторы для S. cerevisiae. 137

Прямая экспрессия в S. cerevisiae. 137

Секреция гетерологичных белков, синтезируемых S. cerevisiae. 139

Другие дрожжевые системы экспрессии.. 140

Синтез поверхностного антигена вируса гепатита В.. 141

Синтез бычьего лизоцима С2. 142

Системы экспрессии с использованием культур клеток насекомых. 143

Система экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов. 144

Получение рекомбинантных бакуловирусов. 145

Синтез ß-глобина кролика в культуре почечных клеток обезьяны, инфицированных рекомбинантным SV40 146

Создание челночного вектора на основе бакуловирусов для E. coli и клеток насекомых. 146

Выделение рекомбинантного белка из клеток насекомых с помощью аффинного связывания. 149

Экспрессирующие векторы для работы с клетками млекопитающих. 149

Селективные маркерные гены.. 150

Экспрессия двух клонированных генов в одной клетке млекопитающих. 151

ЛИТЕРАТУРА.. 155

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 156

ГЛАВА 8 Направленный мутагенез и генная инженерия белков. 158

Направленный мутагенез: методика. 159

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ДНК фага M13. 159

Олигонуклеотид-направлепный мутагенез с использованием плазмидной ДНК.. 161

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации. 163

Случайный мутагенез с использованием «вырожденных» олигонукмотидных праймеров. 163

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием векторов на основе фага M 13: эффективный универсальный метод внесения точковых мутаций в любой фрагмент ДНК.. 165

Случайный мутагенез с использованием аналогов нуклеотидов. 166

Генная инженерия белков. 168

Образование дополнительных дисульфидных связей. 168

Замена аспарагина на другие аминокислоты.. 170

Уменьшение числа свободных сульфгидрильных групп. 170

Повышение ферментативной активности. 171

Изменение потребности ферментов в металлических кофакторах. 172

Изменение специфичности фермента. 173

Повышение стабильности и специфичности фермента. 174

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 175

ЛИТЕРАТУРА.. 175

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 176

ЧАСТЬ II. Mолекулярная биотехнология микробиологических систем 179

ГЛАВА 9. Молекулярная диагностика. 181

Методы иммунодиагностики.. 182

Ферментный иммуиосорбентный анализ. 182

Моноклональные антитела. 184

Образование и отбор гибридных клеток. 185

Идентификация гибридных клеточных линий, секретирующих специфические антитела. 185

Системы ДНК-диагностики.. 187

Гибридизационные зонды.. 188

Диагностика малярии. 188

Выявление аллелей ß-глобиноиого гена методом гибридизации с синтетическими олигонуклеотидами 189

Выявление Trypanosoma cruzi 189

Нерадиоактивные методы детекции. 190

Геномная дактилоскопия. 192

Использование полиморфных ДНК-маркеров. 194

Молекулярная диагностика генетических заболеваний.. 195

Серповидноклеточная анемия. 195

Метод ПЦР/ЛОЗ. 196

Генотипирование с использованием флуоресцентно меченных ПЦР-праймеров. 198

Мутации в разных сайтах одного гена. 199

Перспективы.. 201

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 201

ЛИТЕРАТУРА.. 202

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 203

ГЛАВА 10. Микробиологическое производство лекарственных средств. 204

Лекарственные препараты.. 204

Выделение кДНК интерферонов. 204

Интерфероны человека, полученные методом генной инженерии. 207

Гормон роста человека, полученный методом генной инженерии. 208

Оптимизация генной экспрессии. 208

Ферменты.. 209

ДНКаза I. 209

Альгинат-лиаза. 209

Моноклональные антитела как лекарственные средства. 210

Структура и функции антител. 211

Профилактика отторжения трансплантированных органов. 212

Лекарственные вещества, связанные с моноклональными антителами. 212

Моноклональные антитела человека. 214

Полипептид, обладающий действием лейкоцитарного интерферона человека, синтезируется в Е. coli. 215

Гибридные моноклональные антитела человека и мыши. 215

Производство антител с помощью Е. соli 218

Лекарственные средства против ВИЧ.. 222

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 224

ЛИТЕРАТУРА.. 224

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 226

ГЛАВА 11. Вакцины.. 227

Субъединичные вакцины.. 228

Противогерпетические вакцины.. 230

Противоящурные вакцины.. 230

Противотуберкулезные вакцины.. 231

Пептидные вакцины.. 231

Генная иммунизация. 233

Аттенуированные вакцины.. 234

Иммунизация с помощью пептида, синтезированного исходя из данных о нуклеотидной последовательности РНК вируса ящура. 235

Противохолерные вакцины.. 235

Противосальмонеллезные вакцины.. 236

Противолейшманиозные вакцины.. 237

«Векторные» вакцины.. 238

Противовирусные вакцины.. 238

Противобактериальные вакцины.. 242

Бактерии кок системы доставки антигенов. 242

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 243

ЛИТЕРАТУРА.. 244

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 246

ГЛАВА 12 Использование рекомбинантных микроорганизмов для получения коммерческих продуктов 247

Эндонуклеазы рестрикции.. 247

Малые биологические молекулы.. 250

Синтез L-аскорбиновой кислоты.. 250

Синтез индиго. 252

Синтез аминокислот. 255

Антибиотики.. 257

Клонирование генов биосинтеза антибиотиков. 259

Синтез новых антибиотиков. 259

Разработка новых методов получения поликетидных антибиотиков. 260

Усовершенствование производства антибиотиков. 263

Получение 2-кето-L-гулоната промежуточного продукта синтеза L- аскорбиновой кислоты — с помощью рекомбинантной бактерии Erwinia herbicola. 265

Биополимеры.. 266

Создание рекомбинантной бактерии Xanthomonas campestris с целью получения ксантановой слизи 266

Выделение генов биосинтеза меланина. 267

Микробиологический синтез животного биополимера с адгезивными свойствами. 268

Микробиологический синтез каучука. 270

Микробиологический синтез полигидроксиалканоатов. 270

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 272

ЛИТЕРАТУРА.. 272

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 274

ГЛАВА 13. Биодеградация токсичных соединений и утилизация биомассы.. 275

Деградация ксенобиотиков с помощью микроорганизмов. 275

Метаболические пути биодеградации ксенобиотиков, созданные методами генной инженерии 276

Перенос плазмид. 276

Изменение генов. 281

Утилизация крахмала и сахаров. 286

Промышленное производство фруктозы и этанола. 287

Получение мультиплазмидных микроорганизмов, способных утилизировать несколько соединений 289

Повышение эффективности производства фруктозы и этанола. 289

Zymomonas mobilis. 292

Получение силоса. 294

Утилизация целлюлозы.. 294

Компоненты лигноцеллюлозы.. 294

Выделение прокариотических целлюлозных генов. 296

Выделение эукариотических целлюлазных генов. 298

Манипуляции с целлюлозными генами. 300

Белок одноклеточных организмов. 301

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 302

ЛИТЕРАТУРА.. 303

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 305

ГЛАВА 14. Бактерии, стимулирующие рост растений. 306

Фиксация азота. 306

Нитрогеназа. 308

Компоненты.. 308

Генная инженерия кластера генов нитрогеназы.. 310

Гидрогеназа. 313

Метаболизм водорода. 313

Модификация генов гидрогеназ. 314

Образование клубеньков. 316

Конкуренция среди организмов, образующих клубеньки. 316

Манипуляции с генами образования клубеньков. 316

Идентификация генов образования клубеньков Rhizobium meliloti путем прямой комплементации Nod^–- мутантов 319

Биоконтроль патогенных микроорганизмов. 320

Сидерофоры.. 321

Антибиотики. 322

Ферменты.. 323

Образование кристаллов льда и антифризные белки. 325

Стимуляция роста растений свободноживущими бактериями.. 326

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 327

ЛИТЕРАТУРА.. 328

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 330

ГЛАВА 15. Микробные инсектициды.. 331

Токсин, синтезируемый Bacillus thuringiensis. 332

Механизм действия и использование. 332

Идентификация генов токсинов. 335

Генная инженерия генов токсинов В. thuringiensis. 336

Клонирование и экспрессия гена, кодирующего токсин Bacillus thuringiensis, в Escherichia coli 338

Бакуловирусы как инструмент биоконтроля. 342

Механизм действия. 342

Усиление биоконтроля с помощью генной инженерии. 343

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 344

ЛИТЕРАТУРА.. 345

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 347

ГЛАВА 16. Промышленный синтез белков при участии рекомбинантных микроорганизмов 349

Рост микроорганизмов. 350

Периодическая культура. 351

Периодическая культура с добавлением субстрата. 352

Непрерывная культура. 353

Повышение эффективности ферментации.. 354

Экспрессия гена гемоглобина стимулирует синтез белка в Е. соli в условиях недостатка кислорода 355

Культуры с высокой плотностью.. 356

Биореакторы.. 357

Типичные крупномасштабные системы ферментации.. 359

Двухступенчатая ферментация в тандемных эрлифтных биореакторах. 360

Двухступенчатая ферментация в одном реакторе с механическим перемешиванием.. 362

Периодическая ферментация и периодическая ферментация с добавлением субстрата. 363

Сбор клеток.. 363

Разрушение клеток.. 365

Дальнейшая обработка. 366

Солюбилизация белков. 367

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 367

ЛИТЕРАТУРА.. 368

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 369

ЧАСТЬ III. Эукариотические системы.. 371

ГЛАВА 17. Генная инженерия растений: методология. 373

Трансформация растений Ti-плазмидой из Agrobacterium tumefaciens. 373

Грамотрицательная почвенная бактерия. 373

Векторные системы на основе Τi-плазмид. 377

Физические методы переноса генов в растительные клетки.. 379

Бомбардировка микрочастицами.. 380

Применение репортерных генов при трансформации клеток растений.. 381

Эксперименты по экспрессии чужеродных генов в растениях. 382

Регенерация жизнеспособных фертильных растений, синтезирующих октопинсинтазу, из корончатого галла табака после делеции генов, контролирующих образование опухоли.. 383

Выделение различных промоторов и их использование. 383

Введение чужеродных генов в хлоропластную ДНК.. 384

Получение трансгенных растений, не содержащих маркерных генов. 386

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 386

ЛИТЕРАТУРА.. 387

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 388

ГЛАВА 18. Генная инженерия растений: применение. 389

Выведение растений, устойчивых к насекомым-вредителям, вирусам и гербицидам.. 389

Растения, устойчивые к насекомым-вредителям.. 389

Растения, устойчивые к вирусам.. 395

Растения, устойчивые к гербицидам.. 400

Растения, устойчивые к грибам и бактериям.. 401

Светоиндуцируемая экспрессия химерного гена, введенного в Nicotiana tabacum с помощью Ti-плазмидного вектора 403

Получение растений, противостоящих неблагоприятным воздействиям и старению.. 403

Окислительный стресс. 403

Солевой стресс. 404

Созревание плодов. 405

Изменение окраски цветков. 406

Изменение пищевой ценности растений.. 407

Аминокислоты.. 408

Липиды.. 408

Изменение вкуса и внешнего вида плодов. 410

Изменение внешнего вида. 410

Изменение вкуса. 411

Растения как биореакторы.. 412

Антитела. 412

Полимеры.. 412

Чужеродные белки, аккумулирующиеся в семенах. 413

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 413

ЛИТЕРАТУРА.. 413

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 416

ГЛАВА 19. Трансгенные животные. 418

Трансгенные мыши: методология. 419

Использование ретровирусных векторов. 419

Метод микроинъекции ДНК.. 420

Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. 422

Клонирование с помощью переноса ядра. 426

Генетическая трансформация эмбрионов мыши микроинъекцией очищенной ДНК.. 428

Экспрессия гена тимидинкиназы вируса простою герпеса в соматических клетках мыши после инъекции рекимбинантною гена в яйцеклетки.. 428

Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом.. 428

Трансгенные мыши: применение. 430

Трансгенный крупный рогатый скот. 433

Трансгенные овцы, козы и свиньи.. 435

Трансгенные птицы.. 436

Трансгенные рыбы.. 438

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 439

ЛИТЕРАТУРА.. 439

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 441

ГЛАВА 20. Молекулярная генетика человека. 442

Генетическое сцепление и картирование генов. 444

Обнаружение и оценка генетического сцепления учеловека. 446

Анализ сцепления методом максимального правдоподобия: логарифм соотношения шансов (лод-балл) 447

Построение генетических карт хромосом человека. 450

Генетический полиморфизм.. 450

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. 451

Полиморфизм коротких тандемных повторов. 454

Картирование локуса генетического заболевания в определенном районе хромосомы.. 456

Построение генетической карты сцепления человека с помощью метода, основанного на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов. 458

Часто встречающиеся типы полиморфизма у человека, которые можно типировать с помощью полимеразной цепной реакции.. 458

Построение мультилокусных хромосомных карт человека. 459

Локализация гена заболевания на карте сцепления. 460

Картирование с использованием радиационных гибридов. 460

Физическое картирование генома человека. 462

Построение контигов из YAC-, ВАС-и PAC-библиотек. 462

Построение контигов из космидных, P1- и λ-библиотек. 463

Транскрипционное картирование. 465

Клонирование генов заболеваний человека. 467

Выявление мутаций в генах человека. 467

Функциональное картирование. 468

Кандидатное картирование. 469

Позиционное картирование. 469

Позиционно-кандидатное картирование. 476

Программа «Геном человека». 477

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 479

ЛИТЕРАТУРА.. 481

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 482

ГЛАВА 2l. Генная терапия. 483

Генная терапия ex vivo. 487

Создание «пакующей» клеточной линии и ее использование для производства хелпер-независимого дефектного ретровируса. 492

Генная терапия in vivo. 493

Вирусные системы доставки генов. 493

Ретровирусные векторы.. 493

Аденовирусные векторы.. 494

Векторы на основе аденоассоциированных вирусов. 496

Векторы на основе вируса простого герпеса. 496

Невирусные системы доставки генов. 498

Активация предшественника лекарственного вещества («пролекарства») 503

Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов. 503

Синтез «антисмысловых» мРНК in vivo. 504

«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства. 506

Олигонуклеотиды, связывающиеся с белками: антитромбиновый аптамер. 508

Рибозимы как лекарственные средства. 508

Коррекция генетических дефектов с помощью олигонуклеотидов. 509

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 510

ЛИТЕРАТУРА.. 511

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 513

ЧАСТЬ IV. Контроль исследований в области молекулярной биотехнологии и патентование биотехнологических изобретений 515

ГЛАВА 22. Контроль применения биотехнологических методов. 517

Контроль экспериментов с рекомбинантными ДНК.. 518

Контроль за производством и потреблением пищевых продуктов и пищевых добавок.. 519

Химозин. 520

Триптофан. 520

Бычий соматотропин. 521

Контролируемое высвобождение генетически модифицированных организмов в окружающую среду 523

Pseudomonas syringae, не образующие кристаллов льда. 523

Открытые полевые испытания других генетически модифицированных организмов. 525

Возможная биологическая угроза, связанная с рекомбинантными ДНК.. 526

Генная терапия человека. 526

Политика в области генной терапии соматических клеток. 527

Накопление дефектных генов в будущих поколениях. 528

Генная терапия клеток зародышевой линии. 529

Клонирование человека. 529

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 530

ЛИТЕРАТУРА.. 531

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 532

ГЛАВА 23. Патентование биотехнологических изобретений ¹⁾ 533

Общие вопросы патентования изобретений.. 534

Патентование изобретений в разных странах. 536

Патентование ДНК-последовательностей.. 537

Трансгенные млекопитающие, не относящиеся к человеку. 538

Патентование многоклеточных организмов. 539

Патентование и фундаментальные исследования. 539

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.. 541

ЛИТЕРАТУРА.. 541

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ... 542

Словарь терминов. 543

Предметный указатель¹) 566

Указатель латинских названий. 582

Оглавление. 584

ЭЛЕКТРОННОЕ ОГЛАВЛЕНИЕ.. 592