Ход работы. 1. Подготовить установку к работе

1. Подготовить установку к работе. Установка состоит из стеклянного реактора с мешалкой, рубашкой и обратным холодильником. Обогрев осуществляется подачей горячей воды из ультратермостата. При подготовке установки к работе необходимо:

а) подсоединить рубашку реактора к ультратермостату;

б) подсоединить мешалку и обратный холодильник;

в) проверить работу мешалки;

г) включить подачу холодной воды в обратный холодильник;

д) установить с помощью контактного термометра температуру воды 82÷83^оС;

е) включить подачу воды в реактор.

2. Взвесить 37 г сухих дрожжей. Приготовить 170 мл экстрагента (1,5 моль/л диаммонийфосфата), для этого рассчитать требуемое количество концентрированного раствора соли и воды. Концентрация исходного раствора соли задается преподавателем.

3. После прогрева термостата до требуемой температуры экстракции (80^оС) внести в реактор через свободное горло 37 г сухих дрожжей и 170 мл приготовленного экстрагента. Затем включить мешалку. Когда суспензия прогреется до требуемой температуры (80^оС), через обратный холодильник добавить 5 мл концентрированного раствора аммиака и начать отсчет времени экстракции (15 мин).

4. По истечении этого времени отключить подачу воды в обратный холодильник и рубашку реактора, отсоединить мешалку, термометр и холодильник, перелить содержимое реактора в коническую колбу или стакан и охладить до комнатной температуры.

5. Охлажденную суспензию по 25 мл разлить в центрифужные стаканы и отцентрифугировать при 6000 об/мин в течение 15 мин. Денуклеинизированную биомассу собрать в отдельный стакан и оставить для выполнения части 2 лабораторной работы. Полученный бесклеточный экстракт при необходимости отфильтровать через бумажный фильтр и поставить на 30 мин в холодильник, измерив его объем.

6. Измерить концентрацию нуклеиновых кислот в экстракте методом А.С. Спирина (см. Приложение 1). Пробу экстракта необходимо для анализа развести в 200 раз.

7. Провести осаждение РНК в ИЭТ. Для этого необходимо поместить в охлажденный экстракт электроды рН-метра и довести значение рН среды до 1,8÷2,0 раствором концентрированной соляной кислоты. Стакан с осадком поставить на 30÷40 мин в холодильник.

8. Осадок РНК отделить от надосадочной жидкости центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин. Осадок промыть подкисленной водой, добавив по 10 мл последней в каждый центрифужный стакан. При необходимости промывные воды отделить центрифугированием (6000 об/мин в течение 5 мин).

9. Промыть осадок спиртом или ацетоном, добавив в каждый центрифужный стакан по 10 мл растворителя. Отработанный растворитель при необходимости отделить центрифугированием (6000 об/мин в течение 5 мин) и слить в сборник отработанного спирта (ацетона).

10. Осадок РНК высушить в центрифуге, включив ее на 20 мин при 1000 об/мин с открытой крышкой. Определить массу полученного осадка.

11. Измерить объем надосадочной жидкости, полученной в п. 8, и определить в ней концентрацию нуклеиновых кислот методом Спирина.

12. Навеску полученной РНК массой 200 г растворить в 0,1 н NaOH в мерной колбе на 25 мл. Определить содержание в препарате нуклеиновых компонентов по методу А.С. Спирина и белковых веществ по методу Лоури (см. Приложение 1). Для анализа по методу А.С. Спирина полученный раствор развести в 100 раз.

В работе необходимо рассчитать:

а) степень экстракции нуклеиновых компонентов:

Х_экст = [НК]_э V_э /(m A /100),

где [НК]_э – концентрация нуклеиновых кислот в экстракте, мг/л;

V_э – объем экстрагента, равный 175 мл (170 мл соли и 5 мл аммиака), л;

m – масса исходных дрожжей, мг;

А – содержание нуклеиновых кислот в дрожжах (% задается преподавателем).

б) степень осаждения РНК в ИЭТ:

Х_иэо = ([НК] V₁ - [НК]_н/о V₂)/[НК]_эV₁,

где V₁ – объем экстракта, л;

V₂ – объем надосадочной жидкости, л;

[НК]_н/о – концентрация нуклеиновых кислот в надосадочной жидкости, мг/л.

Контрольные вопросы

1. Роль нуклеиновых кислот в микробной клетке.

2. Практическое значение препаратов нуклеиновых кислот и продуктов их гидролиза.

3. Способы извлечения нуклеиновых кислот из микробной клетки.

4. Роль аммиака и диаммонийфосфата в экстракции РНК из клеток дрожжей.

5. Известно, что степень осаждения РНК в изоэлектрической точке растет с увеличением концентрации РНК в растворе. Какие способы Вы можете предложить для концентрирования полученного в данной работе экстракта?

6. Какой растворитель (спирт или ацетон) целесообразнее использовать для сушки РНК и почему?

7. Известен способ извлечения РНК из клеток дрожжей в виде белково-нуклеинового комплекса. Предложите состав экстрагента для этого случая.

Часть 2. Выделение “глобулиновой” фракции белка дрожжей