Выбор разведений для посева

Количество разведений готовят для каждого вида для получения изолированных колоний на поверхности агаризованной среды. Разведения готовят в пробирках с 9 мл стерильной водопроводной воды. Отобранную пробу суспензии тщательно, равномерно размешивают и затем отбирают и переносят пипеткой 1 мл в пробирку с 9 мл стерильной воды (первое разведение 1:10). Суспензию полученного первого разведения необходимо тщательно перемешать с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру повторяют 3÷5 раз, что обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку – это второе разведение – 1:100. Аналогично готовят и последующие разведения.

Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в суспензии и, соответственно, число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходной суспензии или субстрате. Обычно это 5÷8, чаще всего 6 разведений. Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку! Пренебрежение этим простым правилом может привести к получению ошибочного результата, иногда в 100 и более раз превышающего истинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки. Часть клеток, оставшихся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что явится причиной получения завышенного результата.

Для подавления роста бактерий в анализируемую дрожжевую суспензию либо в расплавленный и остуженный до 45°С сусло-агар добавляют антибиотики – трептомицин, неомицин (50 ед/мл), тетрациклин, окситетрациклин и хлортетрациклин (0,002÷005 мг/мл).

Посев осуществляют стерильной пипеткой из последних разведений, начиная с самого последнего. После тщательного перемешивания отбирают 0,1 мл суспензии и наносят на поверхность сусло-агаровой пластинки в чашке Петри. Этот объем равномерно распределяют по поверхности среды стерильным шпателем.

Для посевов из разных разведений используют новый стерильный шпатель. Чашки с засевными средами заворачивают в бумагу, предварительно записав на крышках дату посева и кратность разведения, переворачивают вверх дном и помещают в термостат (32÷34°С). В качестве контроля проводят посев односуточной культуры производственного штамма дрожжей.

Просмотр выросших колоний осуществляют на 3÷5 сутки. Подсчитывают общее количество дрожжей и грибов. Отдельно определяют количество колоний дрожжей, идентичных производственному штамму, путем сравнения с контрольным посевом, а также количество колоний различных морфологических типов, отличающихся от производственного штамма. Грибная инфекция определяется по процентному отношению колоний грибов к общему числу колоний, выросших на чашке. Колонии дрожжей, сходных с производственным штаммом и отличающихся от него, анализируют по дополнительным тестам.

Дрожжевые варианты, отличающиеся от производственного штамма, относят к посторонним дрожжам.

Результаты анализа записывают в виде дроби

Д/С∙%,

где Д – доминирование производственного штамма в % от общего числа выросших колоний;

С – стабильность производственного штамма в % отношении числа колоний, сходных по морфологии с культурой – продуцентом, к общему числу колоний культуры – продуцента.