Иммобилизованные ферменты и преимущества применения в биотехнологии.

Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная часть общего объема. На практике для иммобилизации ферментов используют рутинные физические и химические методы. Все существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации, при которой фермент не соединяется с носителем ковалентными связями) могут быть подразделены на четыре основные группы:

· адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (или как иногда говорят матрикса);

· включение в поры геля;

· пространственное разделение фермента от остальной части реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны;

· введение фермента а двухфазную реакционную среду, в которой он растворим, но может находиться только в одной из фаз.

Эффективность ферментативных процессов, используемых в самых раз-личных областях человеческой деятельности, удалось увеличить с помощью иммобилизации ферментов. Иммобилизованные ферменты обладают не-сколькими преимуществами над своими растворимыми аналогами:

1) могут быть отделены от продукта и использованы повторно, что снижает стоимость процесса;

2) характеризуются повышенной стабильностью и длительным со-хранением активности;

3) пригодны для непрерывных процессов, которые, в свою очередь, облегчают контроль за качеством и снижают стоимость труда;

4) время реакции может быть уменьшено за счет создания более вы-сокого соотношения ферментов и субстратов;

5) возможностью создания мультиферментных систем.

Однако применение ферментов ограничено из-за их низкой стабиль-ности, способности катализировать только одну единственную реакцию, высокой стоимости чистых препаратов. Кроме того, для практических целей могут использоваться только те ферменты, для которых не требуется регенерации кофакторов. Поэтому в настоящее время наряду с им-мобилизацией ферментов внимание исследователей все больше привле-кает иммобилизация клеток и органелл. Живая клетка в отличие от фер-мента представляет собой готовый биотехнологический реактор, в кото-ром реализуются не только процессы, приводящие к образованию конеч-ного продукта, но и многие другие, способствующие поддержанию ката-литической эффективности системы на высоком уровне (например, реге-нерация кофакторов). Поскольку ферменты функционируют в нативном окружении, их денатурация в процессе работы сводится к минимуму.

Это расширяет число применяемых ферментов и позволяет осуществлять как процессы синтеза, так и процессы деградации. Иммобилизованные клетки идеально подходят для использования в реакторах с перемешиванием, через которые пропускают субстрат. Пре-имуществом таких реакторов является возможность их многократного использования и получения продукта, свободного от фермента. Конечно, использование иммобилизованных клеток не лишено недостатков. На-пример, клеточная стенка или плазматическая мембрана могут препятст-вовать проникновению субстрата к ферменту или диффузии продукта из клетки. Кроме того, возникает необходимость поддержания целостности клеток и удержания их в той фазе роста, в которой синтезируются тре-буемые ферменты. Наконец, из-за большого числа присутствующих в клетке ферментов (что в ряде случаев рассматривается как достоинство)возможно протекание нежелательных побочных реакций.

Для иммобилизации клеток используется множество способов (сорб-ция инертными и ионообменными носителями, ковалентное связывание с полимерным носителем, включение в гель) и носителей разных типов (природные и синтетические полимеры и неорганические вещества). Вклю-чение живых клеток требует мягких условий иммобилизации, носитель при этом должен представлять собой систему открытых пор с хорошими условиями для газообмена. Следует принимать во внимание и возможное вредное влияние на жизнеспособность клеток сшивающих агентов. Наи-большее распространение получило включение клеток в полиакрила-мидный гель и гель альгината кальция. Альгинат – основной структурный полисахарид бурых морских водо-рослей. В присутствии моновалентных катионов полисахарид образует

вязкий раствор, тогда как в присутствии двухвалентных катионов, осо-бенно кальция, наблюдается образование геля. Поскольку гель образует-ся в мягких условиях, в нем можно иммобилизовать живые клетки.

Во-первых, чистые препараты ферментов неустойчивы при длительном хранении, а также при разного рода воздействиях, особенно тепловых.

Во-вторых, в виду сложности отделения ферментов от различных реагентов смеси многократное их использование весьма затруднено. Однако принципиально новые перспективы открылись перед прикладной энзимологией с разработкой принципов создания иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом существенных преимуществ при использовании в прикладных (промышленных целях) производствах по сравнению с чистыми препаратами. Гетерогенный (иммобилизованный) катализатор легко отделить от реакционной среды, что обусловливает:

· возможность остановки реакции в любой нужный момент;

· повторное использование катализатора;

· получение конечного продукта, не загрязненного ферментом.

Последний момент весьма важен при производстве пищевых и медицинских продуктов. Применение иммобилизованного катализатора позволяет проводить ферментный процесс непрерывно и регулировать скорость реакции, а также изменять количество получаемого продукта в соответствии с изменениями скорости протока реакционной смеси. Иммобилизация или некоторая модификация фермента может обусловить изменения и некоторых его свойств (специфичность взаимодействия с субстратом; зависимость каталитической активности от рН, ионного состава и других параметров среды, а также его стабильность по отношению к различного рода денатурирующим воздействиям). Иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их каталитическую активность за счет изменения свойств носителя.

94. носители, используемые для иммобилизации ферментов: природные и синтетические органические носители. Типы неорганических носителей.

Органические полимерные носители

два класса:

1 - природные полимеры (подразделяются на группы в соответствии с их биохимической классификацией: полисахаридные, белковые и липидные носители.)

2 - синтетические полимерные носители. (группы: полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные носители), используются для получения гелей и микрокапсул.

Применение природных полимеров в качестве носителей аргументируется их доступностью и наличием свободных функциональных групп, легко вступающих в разнообразные химические реакции, а также их высокой гидрофильностью. К недостаткам следует отнести неустойчивость к воздействию некоторых микроорганизмов и относительно высокую стоимость многих из них.

Полисахариды

Наиболее часто для иммобилизации ферментов используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Целлюлоза. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют, что делает ее относительно дешевым и удобным для иммобилизации различных ферментов носителем. Однако она неустойчива к действию сильных кислот, щелочей и некоторых окислителей, что ограничивает области ее применения.

Хитин - природный аминополисахарид, напоминающий некоторым образом целлюлозу и является компонентом наружного скелета ракообразных, насекомых, а также входит в состав оболочек некоторых грибов. Являясь отходом промышленной переработки креветок и крабов, данное соединение имеется в достаточно больших количествах при относительно низкой стоимости. Препараты обладают высокой каталитической активностью и устойчивы к микробному воздействию.

Декстран - разветвленный полисахарид бактериального происхождения, содержащий остатки глюкозы.

Гели, приготовленные на основе декстрана, отличаются высокой стойкостью по отношению к различным химическим веществам, что делает их весьма широко используемыми в различного рода исследованиях и на производстве. К группе декстранов может быть отнесен и крахмал. Посредством определенных химических обработок из крахмала получен новый носитель - губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к ферментам, гидролизующим полисахариды.

Агароза - широко используется в качестве носителя для иммобилизации ферментов, однако стоимость ее довольно высока.

Агар - природный полисахарид, выделяемый из клеточных стенок некоторых морских водорослей. Точный состав его не известен, но установлено, что он содержит, по крайней мере, два полисахарида: агарозу и агаропектин. Преимуществом агара является его низкая стоимость и нетоксичность. Некоторые производные агара отличаются высокой механической прочностью и устойчивостью в щелочной среде, что явилось основанием рассматривать данный носитель почти идеальным.

Другими полисахаридами, получаемыми из морских водорослей, являются альгиновые кислоты и их соли, которые после некоторой модификации применяются для иммобилизации ферментов, клеток и клеточных органелл.

Гепарин - кислый полисахарид, успешно применяемый для получения водорастворимых препаратов иммобилизованных ферментов, используемых в медицине.

Полиамидные носители

Главным достоинством носителей этого типа является то, что они могут быть созданы в различной физической форме: в виде гранул, порошков, волокон, мембран, трубок и т. п. Широкое применение таких носителей, особенно для медицинских целей, обусловлено и биологической инертностью, и стойкостью к воздействию биологических факторов.

Неорганические носители создаются на основе силикагеля, глины, керамик, природных минералов, металлов и их оксидов.

Основными качествами, определяющими широкое внедрение неорганических носителей в производственные процессы, является легкость их регенерации и возможность придания им любой конфигурации. Они могут применяться как в виде порошков, шариков, так и монолитов; они могут быть как пористыми, так и сплошными (непористыми).

остоинства микропористых кремнеземов следует отнести механическую прочность, химическую инертность по отношению ко многим растворителям, наличие жесткого скелета с заданным размером пор, а также устойчивость к микроорганизмам. Недостатками кремнеземов является их использование в ограниченном диапазоне рН, а также явление неспецифической сорбции на их поверхности, хотя последнее может быть устранено различными модифицирующими воздействиями. Правда, стоимость кремнеземных носителей относительно высока, и модификация еще больше повышает цену, поэтому внедрение их в промышленность существенно ограничено.

Более пригодными для промышленного использования могут оказаться природные алюмосиликаты - глины, а также пористая керамика, в состав которой, помимо алюмосиликатов, входят окислы титана, циркония или другие добавки. Следует также упомянуть такие широко распространенные носители, как уголь и графитированная сажа. Весьма перспективными носителями являются приготавливаемые на основе металлов и их оксидов, которые характеризуются высокой механической прочностью, относительной дешевизной, стабильностью и хорошими гидродинамическими свойствами.