А. Геномные библиотеки

Геномные библиотеки обычно создают с помощью векторов, сконструированных на основе бактериофага λ или космиды.

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

В составе векторов, можно клонировать фрагменты ДНКразмером до 23 тпн, что обусловило их исполь-

зование при создании так называемых библио-тек генов, или клонотек (геномных библиотек).

Для формирования библиотеки генов какого-либо организма в векторные ДНК встраивают полученные случайным образом крупные фраг-менты изучаемого генома. Расщепление препа-рата высокомолекулярной ДНК на большие вза-

имно перекрывающиеся фрагменты осуществ-ляют чаще всего путем частичного гидролиза мелкощепящей рестриктазой. Фрагментация также возможна с по-мощью физических методов. Для избавления от неспецифического фона (встройка в вектор двухили более несоседних на геноме фрагментов)гидролизат ДНК подвергают фракционирова-нию по размеру и в реакцию лигирования вво-дят фрагменты протяженностью 15-20 тпн,с тем чтобы в векторную ДНК фага Я мог встроиться только один фрагмент. При встройке двухи более фрагментов размер гибридной ДНК бу-дет превышать предельно допустимый. Важнымсвойством этой экспериментальной системы является то, что при упаковке в капсид in vitroпроисходит отбор гибридных молекул фаговойДНК определенного размера (от 38 до 51 тпн).

Другой подход предполагает дефосфорилиро-вание фрагментированной геномной ДНК с кон-цов с помощью фосфатазы. Такие фрагменты не способны лигироваться между собой, но встраи-ваются в векторную ДНК, имеющую нормаль-ные фосфорилированные 5'-концы. В этом слу-чае нет необходимости во фракционированиипрепарата клонируемой ДНК по размерам.При создании библиотеки генов определен-ного организма важно, чтобы каждый сегментизучаемого генома был представлен среди гиб-ридных молекул ДНК. Необходимое количест-во клонов в библиотеке определяется соотно-шением размера генома и среднего размеравставок по формулеизучаемой хромосоме. Последовательно выяв-ляя «соседей», клоны гибридов можно иденти-фицировать и расположить в таком порядке, что-бы их вставки в целом последовательно покры-вали весь геном. Такой набор клонов называют энциклопедией генов. -Космидные библиотеки генов состоят из меньшего числа клонов, чем библиотеки на ос-нове векторных фагов Я . Однако последние все же предпочтительнее в тех случа-ях, когда не требуются фрагменты размером бо-лее 20 тпн.