Генетическая инженерия эукариотических микроорганизмов. Сахаромицеты как базовый организм.(136)

E. Coli – удобная система для экспериментов на прокариотах. Для эукариотических клеток данные системы не подхядят, т к эукариотические клетки обладают специфическими функциями( митоз, мейоз, дифференцировка). Для исследования растительных или животных белков лучше использовать родственные клетки. Но в ряде случаев можно использовать простые для культивирования дрожжевые клетки.

Дрожжевые клетки удобны как продуценты, проявляют высокую генетическую стабильность, не подвергаются фаголизису, не выделеяют токсины.

Для клонирования хорошо зарекомендовали себя S. Cerevisiae. Их геном состоит из 16 хромосом и полностью секвенирован. Содержит 6000 генов. ДНК больше в 3 раза, чем у бактерий.

Экспрессия чужеродных генов может быть функциональной и нефункциональной. В случае функциональной экспрессии чужеродные белки в условиях in vivo проявляют свою активность. Для клонирования фрагментов ДНК в дрожжевых клетках как правило используют челночные векторы: гены можно клонировать в E. Coli, а затем исследовать их экспрессию в дрожжевых клетках. Из дрожжевых клеток трудно выделить значительное количество векторных молекул. Эту процедуру проводят в 2 этапа. Сначала выделяют суммарную ДНК, а затем трансформируют ей E. Coli отбирают клоны по селективным признакам.

Для трансформации дрожжи делают:

1). Плазмида вводится в протопласт. Протопласты получают с помощью бета-гликозилаз (удаляют клеточные стенки). Сорбитол – предотвращает осмотического шока протопластов. Далее протопласты с трансформированной ДНК инкубируют с этиленгликолем и хлористым кальцием. И высевают на твёрдые селективные среды. Там происходит регенерация клеточных стенок и образование колоний трансформантов. Полиэтиленгликоль способствует слиянию протопластов.

2). Трансформация целых клеток обрабатываемых 0,1 м ацетатом лития в присутсвии этиленгликоля. Данный метод проще, но эффективность ниже.

3). Электропорация.

Использование вирусных геномов в качестве векторов для введения генетической информации в клетки животных

Т.к у эукариот (животных) не обнаружено ядерных плазмид, то единственными «донорами» для переноса векторов могут быть вирусы. Вирусы животных плохи для использования потому что:

1. В их геноме нету несущественных областей, которые можно было бы заменить клонированной ДНК. => векторы сконструированные на базе таких вирусов дефектны.

2. Емкость вирусных векторов ограничена, т. к в капсид может упаковываться лишь определённое кол-во ДНК( а гены эукариот очень большие 30 и > пар нуклеотидов).