ТСХ-скринінг «лікарських» отрут.

Процес ідентифікації невідомої лікарської сполуки, що стала причиною отруєння, складається з двох етапів: попереднього і підтверджуючого.

· Попередній етап дозволяє віднести отруту до визначеної групи хімічних сполук і заснований на використанні методу тонкошарової хроматографії (ТСХ) і системи «скринінгу», тобто системи добору, просівання.

Вибір методу тонкошарової хроматографії для пошуку «лікарської» отрути при неспрямованому дослідженні зумовлений багатофункціональністю методу:

· Поділ препаратів і їхніх метаболітів.

· Очищення від домішок.

· Ідентифікація групи або препаратів індивідуальної речовини.

· Кількісна оцінка аналізованого препарату.

Попередній етапскладаєтьсяз двох стадій:

1 стадія - застосовуються загальні системи розчинників, що дозволяють розділити аналізовані речовини на групи, що локалізуються у визначених хроматографічних зонах. У випадку позитивного результату при використанні загальних систем розчинників приступають до другої стадії.

2 стадія - застосовуються окремі системи розчинників, що дозволяють ефективно розділити сполуки, що входять в ту чи іншу хроматографічну зону.

· Підтверджуючий етап – після проведення двох стадій попереднього етапу проводять підтверджуючі дослідження, що включають комплекс хімічних, фізико-хімічних методів, а також фармакологічні проби.

Негативний результат попереднього дослідження навіть на першій стадії свідчить про відсутність токсичних доз лікарських препаратів в екстрактах з біологічного матеріалу.

Попереднє хроматографічне дослідження ефективне за умови аналізу біологічного матеріалу, який не піддався процесам гнильного розкладання.

Умови ТСХ-скринінгу речовин кислого і слабоосновного характеру:

· Загальна система розчинників – ацетон-хлороформ (1:9).

· Хроматографічні пластини з закріпленим шаром силікагелю.

· Довжина пробігу розчинників - 10 см.

· Час насичення камери парами розчинника – 15-20 хв.

Хроматографічна пластина розділяється на 5 вертикальних смуг:

S	A	Б	В	Г
*	*	*	*	*

Стандарт По 1/25 „кислого” хлороформного екстракту – 1/10

Як стандарт використовується циклобарбітал. Після розвитку хроматограми і висушування пластини проводять проялення барбітуратів, похідних саліцилової кислоти, піразолону, алкалоїдів – похідних пурину, індолу, похідних 1,4-бенздиазепіну.

Як проявники використовуються:

· Для барбітуратів- послідовно 5% розчин HgSO₄ і 0,1 % розчин дифенілкарбазону в хлороформі (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями – смуги S і А ),

· Для похідних саліцилової кислоти, піразолону -5% або 10% розчин FeCl₃ (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями - смуга Б),

· Для алкалоїдів, похідних 1,4-бенздиазепіну - реактив Драгендорфа по Муньє (спостерігаються оранжеві, оранжево-коричневі плями - смуга В).

Залежно від значень величин Rf сполуки на хроматограмі поділяють на три хроматографічні зони:

1. Зона з Rf – 0 -0,25 – похідні піразолону, алкалоїди.

2. Зона з Rf – 0,31- 0,41 – барбітурати, похідні 1,4-бенздиазепіну.

3. Зона з Rf – 0,41- 0,64 – похідні 1,4-бенздиазепіну.

Rs – являє собою відношення величини Rf аналізуючої речовини до величини Rf стандарту (циклобарбіталу). Вибір стандарту здійснюють так, щоб величина RS знаходилася в межах - 0,5-2. Величина Rs малочутлива до впливу випадкових відхилень в умовах експерименту і тому є більш точною оцінкою хроматографчної рухомості, ніж Rf.

Шар сорбенту з невиявленої смуги Г, розташований на одному рівні з забарвленою плямою на інших смугах з аналізованим екстрактом, знімають за допомогою скальпеля і елюють досліджувану речовину з:

• хроматографічної зони 1 - метанолом,

• хроматографічної зони 2 і 3 - ацетоном.

Елюат досліджують в окремих системах розчинників:

• Похідні піразолону, алкалоїди (I зона) - ацетон-циклогексан (5:1), сорбент - основний окис алюмінію,

• Барбітурати, похідні 1,4-бенздиаеепіну (2 зона) -хлороформ-бутанол-25% розчин аміаку (70:40:5), сорбент - силікагель КСК, забуферений розчином борної кислоти.

• Похідні 1,4-бенздиазепіну (3 зона) - етилацетат-бензол-етанол-25% розчин аміаку (90:15:5:2,5), силікагель КСК.

Умови ТСХ-скринінгу речовин основного і слабоосновного характеру:

• Загальна система розчинників - хлороформ-диоксан-ацетон-25% розчин аміаку(45:47,5:5:2,5);

• Хроматографічні пластини з закріпленим шаром силікагелю,

• Довжина пробігу розчинників - 10 см,

• Час насичення камери парами розчинника – 15-20 хв.

Хроматограф пластина розділяється на 5 вертикальних смуг

S	A	Б	В	Г
*	*	*	*	*

Стандарт По 1/25 „лужного” хлороформного екстракту – 1/10

Як стандарт використовується етаперазин. Після розвитку хроматограми і висушування пластини проводять проявлення алкалоїдів; похідних фенотіазину, 1,4-бенздиазепіну, п-амінобензойної кислоти, піразолону.

Як проявники використовуються:

· Для похідних фенотіазнну- 10% розчин Н₂SO₄ в етанолі (з'являються червоні і фіолетові плями - смуги S і А);

· Для похідних фенотіазину, піразолону- 5% або 10% розчин FeCl₃ (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями -смуга Б);

· Для алкалоїдів, похідних 1,4-бенздиазепіну, п-амінобензойної кислоти - реактив Драгендорфа по Муньє (спостерігаються оранжеві, оранжево-коричневі плями - смуга В).

Залежно від значень величин Rf сполуки на хроматограмі поділяють на три хроматoграфичні зони:

1. Зона з Rf – 0,12-0,36 – алкалоїди;

2. Зона з Rf – 0,50-0,58 – пурини, похідні піразолону, фенотіазину;

3. Зона з Rf – 0,63-0,83 – похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину, п-амінобензойної кислот;

4. Зона з Rf – 0,6-0,98 – алкалоїди, похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину.

Шар сорбенту з невиявленої смуги Г, розташований на одному рівні з забарвленою плямою на інших смугах з аналізованим екстрактом, знімають за допомогою скальпеля і елюють досліджувану речовину з:

• хроматографічної зони 1 – сумішшю метанол-диетиламін (9:1);

• хроматографічної зони 2 - 4 – сумішшю метанол-25% розчин аміаку (9:1).

Елюат досліджують в окремих системах розчинників:

· Алкалоїди (1 зона) -хлороформ-диетиламін (9:1), сорбент - силікагель КСК;

· Пурини, похідні піразолону, фенотіазину(2 зона)- хлороформ-етанол (5:1), сорбент - нейтральний окис алюмінію;

· Похідні 1,4-бенздиазепіну, фенотіазину, п-амінобензойної кислот(3 зона)– хлороформ-етанол (20:1), сорбент - основний окис алюмінію;

· Алкалоїди, похідні 1,4-бенздназепіну, фенотіазину (4 зона) -циклогексан-ацетон (5:1), сорбент - основний окис алюмінію.

Результати попереднього хроматографічного дослідження підтверджуються хімічними і фізико-хімічними методами аналізу.