КАТЕГОРИИ:
АстрономияБиологияГеографияДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
ЗАНЯТИЕ 32
Цель занятия
1. Знать:
общую характеристику и классификацию методов жидкостной хроматографии;
основные принципы плоскостной жидкостной хроматографии и применение её в анализе, алгоритм получения и интерпретации плоскостных хроматограмм;
основные принципы высокоэффективной жидкостной хроматографии и её отличие от классической жидкостной хроматографии, устройство и принцип работы жидкостного хроматографа, требования к неподвижным и подвижным фазам, используемым в ВЭЖХ;
основные закономерности, лежащие в основе методов жидкостной хроматографии: ионообменной, эксклюзионной и др., используемые неподвижные и подвижные фазы, выбор условий хроматографирования и применение в анализе.
2. Уметь:
проводить хромато-фотометрическое определение аминазина.
1. Жидкостная хроматография. Общая характеристика и классификация.
2. Плоскостная хроматография (бумажная, тонкослойная). Характеристики подвижных и неподвижных фаз. Методика получения плоскостной хроматограммы.
3. Анализ плоскостной хроматограммы. Практическое применение бумажной и тонкослойной хроматографии.
4. Колоночная жидкостная хроматография. Устройство и принцип работы жидкостного хроматографа.
5. Ионообменная хроматография. Характеристика неподвижных и подвижных фаз. Ионообменное равновесие.
6. Практическое применение ионообменной хроматографии. Понятие об ионной и ион-парной хроматографии.
7. Эксклюзионная хроматография. Механизм разделения, характеристика используемых твёрдых носителей и растворителей. Практическое применение.
8. Практическое применение высокоэффективной жидкостной хроматографии в фармацевтическом анализе.
1. Какой вариант жидкостной хроматографии называется высокоэффективным? Чем отличаются нормально-фазовая и обращено-фазовая ВЭЖХ?
2. Охарактеризуйте основные этапы получения и интерпретации плоскостной хроматограммы.
3. В состав некоторых готовых пластинок для ТСХ, выпускаемые различными фирмами, специально добавляют вещества (например, силикат цинка), которые флуоресцируют в УФ-свете (такие пластинки имеют маркировку F или UV). Зачем это делается?
4. Количество исследуемого вещества (объём анализируемого раствора), наносимого на хроматографическую пластинку имеет важное значение. Если количество вещества слишком мало, то его можно не заметить при последующем проявлении. Нанесение на пластинку слишком большого количества исследуемого вещества приводит к размыванию пятна и уменьшению величины Rf. Объясните, почему это происходит?
5. Почему все растворы, используемые в ВЭЖХ, перед применением должны быть освобождены от растворённых в них газов (“дегазированы”)?
6. При работе с какими элюентами: вода, ацетон, метанол, н-гексан, пиридин, бензол использование УФ-детектора с фиксированной длиной волны (254 нм) невозможно?
7. Предложите алгоритм ионообменного разделения смеси нескольких слабых органических кислот (pKa ~ 5). Какой ионообменник следует взять? При каком примерно значении рН следует проводить разделение? От чего будет зависеть порядок выхода компонентов разделяемой смеси из колонки?
8. Эксклюзионная хроматография может быть как колоночной, так и плоскостной, проводиться как в «классическом» варианте, так и в высокоэффективном. Что такое «гель-фильтрационная» и «гель-проникающая хроматография»?
9. Объясните принцип ион-парной хроматографии. Для разделения каких веществ она используется?
10. Охарактеризуйте возможные пути использования жидкостной хроматографии (плоскостной, колоночной) в фармацевтическом анализе.
1. Ниже приведены значения Rf для пяти компонентов анализируемой смеси. Пятно, соответствующее какому компоненту, будет находиться ближе всего к линии фронта растворителя?
1) 0,26; 2) 0,35; 3) 0,58; 4) 0,73; 5) 0,90.
2. Ниже приведены значения коэффициентов распределения для пяти компонентов анализируемой смеси. Пятно, соответствующее какому компоненту, будет находиться ближе всего к линии старта?
1) 1; 2) 5; 3) 10; 4) 20; 5) 50.
3. Найдите выражения, в которых имеются ошибки:
1) значение Rf вещества А оказалось равным 2,25;
2) чем больше разность величин Rf двух веществ, тем меньше величина их коэффициента разделения;
3) величина Rf вещества зависит от температуры;
4) при замене в составе подвижной фазы метанола на ацетон значение Rf вещества изменилось;
5) после проведения хроматографирования вещество осталось на стартовой линии, следовательно, его коэффициент распределения равен 0;
4. Двухмерная ТСХ отличается от одномерной тем, что:
1) элюирование в ней всегда проводят смесью растворителей, состоящей из двух компонентов;
2) разделение в двухмерной ТСХ предполагает использование двух хроматографических пластинок;
3) двухмерная ТСХ всегда проводится в восходящем варианте, а одномерная - в нисходящем;
4) в двухмерной ТСХ проводится два разделения, причём второе в направлении противоположном первому;
5) в двухмерной ТСХ проводится два разделения, причём второе в направлении перпендикулярном первому.
5. В ВЭЖХ используются сорбенты, диаметр частиц которых составляет:
1) 5 нм; 2) 5 мкм; 3) 500 мкм; 4) 5 мм; 5) 500 мм.
6. Смесь хлорид- и бромид-ионов анализируют методом ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Какой из перечисленных детекторов является наиболее подходящим в данном случае?
1) рефрактометрический; 2) кондуктометричекий;
3) спектрофотометрический; 4) масс-спектрометрический;
5) флуориметрический.
7. Смесь катионов щелочных металлов разделяют с помощью ионообменника, содержащего -SO3H группы, используя в качестве элюента водный раствор HCl. В какой последовательности катионы щелочных металлов будут выходить из колонки?
1) Na+, K+, Rb+, Li+; 2) K+, Rb+, Li+, Na+; 3) Rb+, K+, Na+, Li+;
4) Li+, Rb+, K+, Na+; 5) Li+, Na+, K+, Rb+.
8. Заряд матрицы ионообменников (катионитов или анионитов), содержащих какие функциональные группы, практически не будет зависеть от рН?
1) -COO-; 2) -SO3-; 3) -O-; 4) -NH3+; 5) -N(CH3)3+.
9. Сефадексы - это:
1) сополимеры стирола и дивинилбензола; 2) декстрины;
3) производные декстрана; 4) полимеры акриламида;
5) продукты полимеризации тетрафторэтилена
Ниже приведена эксклюзионная хроматограмма для смеси полимеров, обладающих одинаковой химической природой, но разными молярными массами. Найдите последовательность, которая отражает соотношение молярных масс веществ А, B и C.
1) М(А) > M(B) > M(C); 2) M(C) > M(A) > M(B)
3) M(C) < M (B) > M(A); 4) M(B) > M(A) < M(C);
5) M(A) < M(B) > M(C).
При хроматографировании лекарственного вещества димедрола и его N-метильного производного (N-метилдимедрола) на хроматографической пластинке «Сорбфил» при использовании в качестве подвижной фазы 1 М водно-ацетонового раствора NaCl были получены следующие результаты:
| димедрол | N-метилдимедрол | |
Расстояние от линии старта до центра пятна,  , мм
| 56,3 | 50,1 |
Расстояние от линии старта до нижнего края пятна,  , мм
| 53,9 | 47,6 |
| Расстояние от нижней до верхней границы пятна, w, мм | 4,7 | 6,2 |
Рассчитайте значения Rf, 
, N и H для обоих веществ, а также величины коэффициента разделения и разрешения. Длина пробега подвижной фазы (L) составляет 90,0 мм.
Расчётные формулы и полученные величины основных хроматографических характеристик димедрола и N-метилдимедрола выглядят следующим образом:
| Характеристика | Формула | Рассчитанное значение | |
| димедрол | N-метилдимедрол | ||
| Rf | 
| 0,626 | 0,557 |
коэффициент
ёмкости, 
| 
| 0,597 | 0,795 |
| число теоретических тарелок, N | 
| 2,1×103 | 9,4×102 |
| высота эквивалентная теоретической тарелке, H | 
| 4,3×10-2 мм | 9,5×10-2 мм |
Коэффициент разделения и разрешение димедрола и N-метилдимедрола равны:
Полное разделение димедрола и N-метилдимедрола в данных условиях не достигается.
1. При хроматографировании атропина на хроматографической пластинке «Сорбфил» при использовании в качестве подвижной фазы 0,5М водно-ацетонового раствора NaCl были получены следующие результаты: расстояние от линии старта до центра пятна - 49,6 мм, расстояние от линии старта до нижней границы пятна - 46,8 мм, расстояние от нижней до верхней границы пятна - 5,6 мм. Расстояние между линией старта и линией фронта растворителя равно 90,0 мм. Рассчитайте Rf, N и H. Ответ: 0,551; 1,1×103; 8,1×10-2 мм.
2. Рассчитайте значение разрешения для хлоридов тетраэтиламмония и тетрабутиламмония при их разделении методом ТСХ, если при выбранных условиях хроматографирования расстояние между центрами пятен данных веществ равно 6,4 мм, а расстояния между верхней и нижней границами пятна - 4,4 мм для одного вещества и 4,0 мм для другого. Ответ: 1,5.
3. Пробу мочи объёмом 5,00 мл, содержащей берберин, пропустили через сорбционный патрон, содержащий 0,1 г сорбента. При этом берберин количественно адсорбировался на нём. Затем сорбент отмыли от адсорбировавшихся совместно с берберином веществ вначале водой, а затем этанолом и диэтиловым эфиром. После высушивания сорбента берберин количественно десорбировали 0,50 мл смеси 0,03М KH2PO4 с ацетонитрилом (6:4). Полученный элюат анализировали методом ВЭЖХ. Рассчитайте концентрацию берберина в анализируемом образце мочи (нг/мл), если зависимость площади пика (S, ед. оптической плотности×сек) от концентрации берберина в растворе (мкг/мл) описывается уравнением S = 0,412C, а при хроматографировании берберина, содержавшегося в анализируемой моче, был получен пик с S = 0,900. Ответ: 220 нг/мл.
4. При стандартизации раствора NaOH навеску NaCl массой 0,7340 г растворили в воде в мерной колбе вместимостью 100,0 мл. Затем 10,00 полученного раствора пропустили со скоростью 3 мл/мин через колонку с катионообменником КУ-2 в H+-форме, после чего промыли колонку дистиллированной водой до нейтральной реакции. Промывные воды присоединили к элюату. Для титрования полученной смеси потребовалось 14,05 мл стандартизуемого раствора NaOH. Определите молярную концентрацию NaOH в данном растворе. Ответ: 0,08939 моль/л.
5. Динамическая ёмкость некоторого сильнокислотного катионообменника составляет 5,0 ммоль/г. Какой максимальный объём раствора с концентрацией NaCl 9,0 г/л можно пропустить через колонку, в которой находится 5,0 г такого ионообменника в H+-форме, чтобы все ионы Na+ заместились на ионы H+? Ответ: 0,16 л.
1. Тауродезоксихолевую кислоту, содержащуюся в 0,50 мл пробы плазмы крысы, количественно экстрагировали 0,50 мл этилацетата. Полученный экстракт упарили досуха, сухой остаток растворили в 1 капле этилацетата и полностью перенесли на хроматографическую пластинку. После хроматографирования площадь полученного пятна оказалась равной 50 мм2. Рассчитайте концентрацию тауродезоксихолевой кислоты (мкг/мл) в исследуемом образце плазмы. Уравнение зависимости десятичного логарифма площади пятна (мм2) от логарифма массы тауродезоксихолевой кислоты в пятне (нг) имеет вид: lgS = 0,69lgm + 0,02.
2. При определении лекарственного вещества дротаверина (но-шпы) в плазме крови методом ВЭЖХ с использованием папаверина в качестве внутреннего стандарта (концентрация в плазме - 5,00 мкг/мл) были получены следующие результаты:
| С, мкг/мл | S пика дротаверина, ед.оптич.пл.×сек | S пика папаверина, ед.оптич.пл.×сек |
| 0,10 | 0,28 | 2,89 |
| 0,50 | 1,68 | 2,78 |
| 1,00 | 2,84 | 2,62 |
| 5,00 | 13,89 | 2,38 |
Рассчитайте уравнение градуировочного графика С = bKS, где KS=S(дротаверина)/S(папаверина) и определите концентрацию дротаверина в плазме, если S(дротаверина) = 5,00, а S(папаверина) = 2,50.
3. Навеску сильнокислотного катионообменника в H+-форме массой 2,50 г поместили в колонку. Затем через неё пропустили 200 мл 1 М NaCl и промыли водой до нейтральной реакции. Элюат и промывные воды собрали в мерную колбу вместимостью 500,0 мл. Для титрования 50,0 мл полученного раствора потребовалось 10,20 мл 0,1000 М NaOH. Определите динамическую ёмкость используемого катионообменника (ммоль/г).
ХРОМАТО-ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНАЗИНА
Аминазин является лекарственным веществом из группы нейролептиков и используется для лечения различных психических расстройств. Методика хромато-фотометрического анализа драже аминазина включает в себя ТСХ-разделение компонентов, входящих в состав драже, и фотометрическое определение выделенного аминазина по реакции с эозином.
ТСХ-разделение проводится на пластинке «Силуфол», которая представляет собой алюминиевую фольгу, на которой с помощью крахмала закреплён тонкий слой силикагеля. В качестве подвижной фазы используется смесь ацетона и 0,25 М NaBr в объёмном соотношении 1:1. Для проявления хроматограммы применяется реактив Драгендорфа (K[BiI4]). Пятна на хроматограмме, соответствующие аминазину и другим веществам основного характера, после проявления будут иметь оранжевую окраску (на жёлтом фоне) из-за протекания реакции:
R3NH+ + [BiI4]- ® (R3NH+)×[BiI4]-
Рис. 32.1.Схема разметки хроматографической пластинки и нанесения веществ
Фотометрическое определение аминазина по реакции с эозином имеет тот же принцип, что и аналогичное определение этония (см. с. 256 - 257).
Определение аминазина в драже проводят по следующей методике. Одно драже аминазина растворяют в 5,0 мл этанола. После отстаивания отмеривают с помощью автоматической пипетки 0,020 мл полученного раствора и количественно переносят капилляром на линию старта в зону хроматографической пластинки (рис. 32.1). В зону В аналогичным образом наносят 0,020 мл стандартного раствора аминазина (5,0 мг/мл). В зону А наносят капилляром стандартный раствор аминазина (около 5 мкл). Пластину подсушивают и помещают в хроматографическую камеру в систему ацетон: 0,25 М NaBr (1:1). Высота подъёма фронта растворителя 5 см. После высушивания пластинку разрезают на отдельные зоны и зону А проявляют реактивом Драгендорфа. По расположению оранжевого пятна в зоне А определяют нахождение аминазина в зонах В и С. Отдельно снимают слой сорбента с зоны В и С, переносят в две пробирки из полиэтилена вместимостью 1 мл. Прибавляют 1,0 мл 0,01 М НСI, центрифугируют полученные растворы и количественно переносят надосадочную жидкость в экстракционные пробирки. В каждую пробирку прибавляют по 0,5 мл 0,1% раствора ПВС, 0,5 мл 0,07% раствора эозина и разбавляют водой до 10,0 мл. Измеряют оптическую плотность стандартного и исследуемого растворов на КФК - 2 МП при 540 нм в кювете с толщиной слоя 2 см относительно раствора, содержащего все перечисленные выше компоненты за исключением аминазина. Массу аминазина в одном драже рассчитывают по формуле:
где Ас - оптическая плотность стандартного раствора аминазина после хроматографирования; Ах - оптическая плотность исследуемого раствора; 5,0×10-3 - концентрация аминазина в стандартном растворе (мг/мл); 5,0 - объём исследуемого раствора (мл).
Дата добавления: 2015-08-05; просмотров: 149; Мы поможем в написании вашей работы!; Нарушение авторских прав |