Глюкозидазы

4.1.1. Выделение a– и b– амилаз солода.

Амилазы гидролизуют различные соединения: амилозу, амилопектин, гликоген, олигосахариды и родственные им вещества, построенные из остатков a–D–глюкопиранозы и содержащие в молекулах 1,4 –1,6 гликозидные связи.

Активные центры амилаз образованы радикалами гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, а также тирозина. Последнему приписывают функцию связывания субстрата, а первым трем – каталитическую функцию. Предполагают следующий механизм распада гликозидных связей 1,4 – 1,6 при участии амилаз (см. рисунок 3 (I стадия)).

На второй стадии в активный центр фермента входит молекула воды, присоединения ОН групп, которой обеспечивает распад возникшей сложно–эфирной связи и высвобождение радикала дикарбоновой аминокислоты; протон воды присоединяется к депротонированному на 1–ой стадии радикалу гистидина (см. рисунок 4 (II стадия)).

В результате восстанавливается структура активного центра фермента, и он готов к осуществлению следующего каталитического акта в гидролизе гликозидной связи.

Рисунок 3

Рисунок 4

Предполагают, что не только амилазы, но и все другие гликозидазы действуют в соответствии с приведенным ниже механизмом.

Известны три вида амилаз, различающихся по распространению в природе, по ряду свойств и главным образом по конечным продуктам ферментативного действия.

a–Амилаза (a–1,4–глюкан–4–глюканогидролаза) – фермент гидролизует внут-ренние a–1,4– глюкозидные связи в субстратах, приводя в конечном итоге к образованию мальтозы, некоторого количества глюкозы и различных низкомолекулярных олигосахаридов с разветвленной цепью.

b–Амилаза (a–1,4–глюканмальтогидролаза) и глюкоамилаза (a–1,4–глюкан глюкогидролаза) в отличие от a–амилазы гидролизуют наружные нередуцирующие концы цепей полисахаридов, последовательно отщепляя соответственно мальтозные и глюкозные остатки. Действие b–амилазы и глюкоамилазы прекращается, как правило, вблизи первой точки ветвления полисахарида, образованного a–1,6– глюкозидной связью. Поэтому, помимо мальтозы и глюкозы, под действием b–амилаз и глюкоамилаз образуются декстрины (олигосахариды) высокой молекулярной массы.

Ход работы.20 г измельченного солода помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки дистиллированной водой и переносят в фарфоровый стакан. Затем массу размешивают 15 минут, оставляют на 2 часа в холодильнике, перемешивают, отжимают через ткань и центрифугируют. Вытяжка из солода содержит a–и b– амилазы.

Выделение a–амилазы

10 мл солодовой вытяжки нагревают в пробирке при 70 °С в течение 15 минут, после чего раствор охлаждают и используют для исследования активности фермента. b–амилаза при этой температуре инактивируется.

Выделение b–амилазы

15 мл солодовой вытяжки вносят в стакан, добавляют 3 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты и 12 мл воды до общего объема 30 мл (рН при этом должно быть 3,3) и оставляют в холодильнике на15 мин. Затем к раствору добавляют 6 мл 0,15 М раствора фосфорнокислого натрия (двухзамещенного) с целью доведения рН среды до 6,0. Раствор берут для определения осахаривающей способности b–амилазы, так как a– амилаза в кислой среде инактивирована.

4.1.2. Определение декстринирующей способности a–амилазы

Принцип действия. При действии на крахмал a–амилазы: образуется большое количество декстринов разного молекулярного веса, по–разному окрашивающихся йодом – амилодекстрины, эритродекстрины, ахродекстрины, мальтодекстрины.

Ход работы.В шесть пробирок вносят по 5 мл 2 %–ного раствора растворимого крахмала. В каждую пробирку добавляют по 1 мл буферного раствора с рН 5,6. Раствор фермента и воду вносят в количествах, указанных в таблице 2:

Растворы в пробирках хорошо перемешивают и ставят в термостат при 40 °С. Глубину гидролиза крахмала контролируют по четвертой пробирке. Для этого из нее стеклянной палочкой периодически отбирают пробы на белую кафельную плитку, добавляя к ней раствор Люголя. Первый отбор пробы делают через пять минут после термостатирования. Пробирки выдерживают в термостате до тех пор, пока проба из четвертой пробирки не окрасится в красно–бурый цвет, что свидетельствует об образовании в этой пробирке эритродекстринов.

Таблица 2 – Основные параметры опыта и его результаты

После этого в каждую пробирку добавляют по 2–3 капли раствора йода и 20 %–ного раствора соляной кислоты для остановки гидролиза крахмала. Содержимое пробирок окрашивается в различные цвета: от синего в первой пробирке с крахмалом до желтого – в последней, через фиолетовый и красно–бурый.

Анализируя окраску с йодом, в таблицу 2 следует записать, до каких декстринов прошел гидролиз крахмала в каждой пробирке в зависимости от количества фермента.

Материалы и реактивы. Солод; 0,1 н раствор HCI; 0,15 М раствор фосфата натрия (двузамещенный); 2 % – ный раствор крахмала; 0,1 М раствор фосфатного буфера, рН 5,6 (см. Приложение 1, п.3); 20 %–ный раствор НСI; раствор Люголя.

Оборудование. Термостат; холодильник; центрифуга; кафельные плитки; стеклянные палочки; пипетки на 5,10,15 мл; фарфоровые стаканы; водяная баня.

4.1.3. Влияние температуры на осахаривающую способность b–амилазы

Каталитическая активность ферментов значительно зависит от температуры. При низкой температуре ( 0 °С, 4 °С) ферментативные реакции протекают с малой скоростью, а при замораживании могут и не происходить. Температурный оптимум многих ферментов лежит в пределах от 40 °С до 50 °С. При нагревании свыше 60–70 °С ферменты инактивируются необратимо, меняя свое строение, что приводит к потере каталитической активности.

Работа выполняется коллективно всей группой, каждый студент получает индивидуальное задание при какой температуре проводить исследование. Опыты ставят при температуре 4 °С (холодильник), 20 °С (комнатная), 30 °С, 40 °С, 50 °С, 60 °С, 70 °С (водяные бани или термостат).

Чтобы получить правильные результаты, необходимо строго соблюдать заданную температуру.

Принцип метода. Для определения осахаривающей способности, характеризующей активность b– амилазы, проводят гидролиз растворимого крахмала исследуемым ферментным препаратом при рН 5,6 и различной температуре. Количество образовавшегося сахара мальтозы определяют методом Бертрана.

Метод Бертрана основан на способности свободной альдегидной или кетонной группы молекулы сахара взаимодействовать со щелочным раствором окисной меди (II) (реактивом Фелинга) и восстанавливать ее до оксида меди (I), выпадающего в виде осадка красного цвета.

По количеству образовавшегося оксида меди (I) судят о содержании сахара в испытуемом растворе.

Реактив Фелинга представляет собой смесь разных объемов 4 %–ной сернокис лой меди и щелочного раствора сегнетовой соли. При смешивании сернокислой меди со щелочью выпадает осадок гидрата окиси меди (II). Сегнетова соль препятствует выпадению осадка, образуя комплексное растворимое соединение.

В щелочной среде циклическая (полуацетальная) форма сахара полностью переходит в ациклическую и на месте свободного гликозидного гидроксила образуется альдегидная (у альдоз) или кетонная (у кетоз) группа.

Сu⁺ – е ¾® Cu⁺⁺

Fе⁺⁺⁺ + е ¾® Fе⁺⁺

Количество восстановленного железа, эквивалентное количеству оксида меди (I), определяют титрованием раствором перманганата. Весь процесс сводится к следующим реакциям:

Сu₂О + Fе₂(SО₄)₃ + Н₂SО₄––> 2 СuSО₄ + 2 FеSО₄ + Н₂О;

10 FеSО₄+2 КМnО₄ + 8 Н₂SО₄––> 2Fе₂(SО₄)₃+ К₂SО₄ +2 МnSО₄ + 8 Н₂О

Титр перманганата устанавливают по меди, что дает возможность сразу пересчитать объем пошедшего на титрование перманганата на эквивалентное количество миллиграммов оксида меди (I).

Ход работы. В колбу вносят 10 мл 2 % –ного крахмального клейстера и 2 мл фосфатного буфера рН 5,6. Содержимое колбы доводят до заданной температуры (нагревают или охлаждают), после чего вносят 1 мл ферментной вытяжки, предварительно термостатированной при той же температуре, и замечают время. Гидролиз проводят 30 минут, в течение которых строго следят за поддержанием заданной температуры. Через 30 мин. в колбу вносят 3 мл 6 %– ного раствора сульфата меди для прекращения действия фермента, содержимое колбы охлаждают и доводят водой до 20 мл. Количество образовавшейся мальтозы определяют методом Бертрана. Для этого в коническую колбу пипеткой отбирают 10 мл полученного гидролизата, добавляют 10 мл воды и 40 мл реактива Фелинга (смесь 20 мл Фелинга 1 и 20 мл Фелинга II).

Испытуемый раствор с жидкостью Фелинга нагревают до кипения и кипятят 3 минуты. Кипение должно идти спокойно, жидкость в колбе должна оставаться синей, что указывает на избыток реактива Фелинга, а, следовательно, и на полноту окисления.

Сняв раствор с огня, дают некоторое время для осаждения оксида меди (I), затем жидкость декантируют через асбестовый фильтр в колбу Бунзена, соединенную с отсасывающим насосом. Оксид меди (I) должен остаться в колбе, но часть его может перейти на фильтр. Осадок в колбе 3–4 раза промывают небольшими порциями горячей воды, декантируя через тот же асбестовый фильтр. Осадок в колбе и на фильтре, во избежание его окисления кислородом воздуха, должен все время находиться под жидкостью.

После отмывания осадка Сu₂О от щелочи колбу Бунзена отключают от насоса, содержимое ее выливают. В чисто промытую колбу Бунзена вставляют тот же асбестовый фильтр. Промытый осадок оксида меди (I) в колбочке растворяют 15–20 мл железоаммиачных квасцов и количественно переносят на асбестовый фильтр. Для лучшего растворения осадка на фильтре верхний слой асбеста слегка разрыхляют стеклянной палочкой.

Когда осадок растворится, соединяют колбу Бунзена с насосом и отсасывают жидкость с фильтра. Колбочку, где был осадок, тщательно ополаскивают несколько раз водой, и промывные воды отсасывают в колбу Бунзена. Зеленоватый раствор в колбе Бунзена, содержащий ионы железа (II) , титруют раствором КМnО₄ до слаборозовой окраски, не исчезающей в течение одной минуты. Израсходованное на титрование количество мл 0,1 н. раствора перманганата (с учетом поправки на титр) умножают на его титр по меди (6,36 мг Си₂О) и по таблице (см. Приложение 2, таб.3) определяют количество мальтозы.

Мерой активности b–амилазы служит количество разложившегося крахмала ферментом, содержащемся в 100 г исследуемого растительного материала (солода) в условиях опыта.

, (9)

где Х – активность фермента, %;

а – количество мальтозы, г;

0,95 – коэффициент пересчета мальтозы в крахмал;

н– навеска муки в испытуемой смеси, г.

Результаты записывают в таблицу 3 и строят график зависимости активности
b–амилазы от температуры.

Таблица 3 – Зависимость активности b-амилазы от температуры

Материалы и реактивы. Ферментная вытяжка; растворимый крахмал,2 % раствор; фосфатный буфер,0,1 М раствор; сульфат меди,6 % раствор; Фелинг I – сульфат меди,4 % раствор; Фелинг II (см. Приложение 1,п.4); железоаммиачные квасцы (см. Приложение 1,п.5); перманганат калия, 0,1 н раствор.

Оборудование. Термостат; водяные бани; стеклянный фильтр; колбы Бунзена; плоскодонные колбы на 100 мл; бюретки; стеклянные палочки.