Определение протеолитической способности (ПС)

Важным этапом технологии многих пищевых производств являются биохимические превращения белков, происходящие под действием протеолитических ферментов.

В основе определения протеолитической активности лежат различные принципы: изменение физико–химических свойств субстратов, определение убыли субстрата, учет количества продуктов протеолиза.

Контроль по убыли субстрата в основном позволяет судить об активности протеиназ, так как при этом определяется количество непрогидролизованного белка. Поэтому метод можно использовать для характеристики протеолитических препаратов, применяемых в различных отраслях промышленности.

Принцип метода. Заключается в гидролизе казеина известным количеством ферментного препарата и определении степени расщепления белка по уменьшению количества соляной кислоты, связываемой оставшимся непрогидролизованным казеином. После ферментного воздействия в течение 1 ч в опыте и перед добавлением такого же количества ферментной вытяжки в контроле ферментативную реакцию прерывают 0,1 н. раствором соляной кислоты. Казеин, оставшийся нерасщепленным, количественно осаждается сульфатом натрия. Выпадая в осадок, казеин увлекает в связанном состоянии соответствующее количество соляной кислоты. Осадки профильтровывают, а 10 мл фильтрата титруют 0,1 н. раствором NаОН. Количество NаОН, израсходованное на титрование в опыте и контроле, принимается за меру протеолитической активности анализируемого объекта.

Этот метод достаточно прост и удобен в работе. За единицу активности принято количество фермента, которое за 1 ч при 30° С катализирует гидролиз 1 г казеина.

Ход работы.В колбочки (плоскодонные или конические) на 100 мл набирают пипеткой по 20 мл раствора казеина и помещают на водяную баню с температурой 30 °С. Через 10 мин в них наливают при перемешивании 10 мл ферментного раствора. Общий объем (казеин и ферментный раствор) должен быть равен 30 мл, так что, если на анализ берется меньше 10 мл ферментного раствора, недостающий до 30 мл объем пополняется дистиллированной водой, которую приливают непосредственно перед введением фермента. Ровно через час в колбу приливают (тоже при перемешивании) пипеткой 20 мл 0,1 н. раствора НCl в 7,5 % Nа₂SО₄ (раствор второй) и немедленно фильтруют до полной прозрачности (возвращая фильтрат на тот же самый фильтр). Контроли (два параллельных определения) ставят таким же образом, только до введения ферментного раствора прибавляют смесь НCl с 7,5 % Nа₂SО₄ и колбы не выдерживают на водяной бане, а раствор сразу фильтруют. В 20 мл фильтрата контроля и опыта оттитровывают 0,1 н. раствором NаОН избыток НСl. Титрование ведут в присутствии двух капель 0,5 %–ного спиртового раствора крезолрота до красного окрашивания. Разность титрований (опыт–контроль) в пересчете на 10 мл фильтрата может составить 0,4–2,5 мл. Если она менее 0,4 или более 2,50 мл, анализ повторяют с большей или меньшей дозировкой фермента, меняя количество вводимого ферментного раствора или его разведение.

Расчет активности. По разности титрования опыта и контроля в миллилитрах 0,1 н. NаОН в перерасчете на 10 мл фильтрата находят единицы активности (см. Приложение 2, табл. 2). В табл. 2 (см. Приложение 2) приведены также значения протеолитической способности при условии, что на анализ введено 10 мл ферментного раствора в разведении 1:100 или 1:50.

Для других количество введенного раствора или других разведений пересчет

ПС производят по следующей формуле:

, (15)

где Е_р – протеолитическая способность;

е – количество единиц, найденное по таблице 2 (см. Приложение 2) в соответствии с результатами титрования;

m– навеска препарата, соответствующая 20 мл фильтрата (1/5 общего количества, взятого на анализ), г.

Пример расчета. 1. Для анализа брали 10 мл ферментной вытяжки 1:50. На титрование опыта пошло 4,2 мл 0,1 н. раствора NаОН, на титрование контроля – 2,0 мл. Разность титрования в пересчете на 10 мл фильтрата /4,2–2,0/:2 = 1,1 мл 0,1 н. раствора NаОН. Величина 1,1 соответствует по таблице Е_р = 1,868.

2. Для анализа брали 5 мл раствора очищенного препарата 1:1000. Разность титрований опыта и контроля равна 1,8 мл 0,1 н. раствора NаОН. Величина 1,8 соответствует по таблице 2 (см. Приложение 2), 0,1353 ед. вычисляем " Е_р".

В 5 мл раствора 1:1000 содержится 0,005 г фермента. Эти 0,005 г находятся в 50 мл реакционной смеси, а в 10 мл фермента 0,001 г.

Полученные величины активности округляют: для культур и сиропов до 0,01, а для очищенных препаратов – 0,1.

Материалы и реактивы. 1. 5 %–ный щелочной раствор казеина (см. Приложение 1, п.13); 0,1 н. раствор НСI в 7,5 %–ном растворе Nа₂SО₄; 0,1 н. раствор NаОН; индикатор – 0,5 %–ный спиртовой раствор крезолрота; раствор фермента (см. Приложение 1, п.14).