ЗАДАЧА 3

При получении генно-инженерного инсулина, основанного на раздельном биосинтезе 2 цепей…

Вариант ответа

Выбор конкретного продуцента рекомбинантных белков, в част­ности инсулина, предусматривает его промышленное применение в качестве суперпродуцента. В этом отношении можно предложить использовать Bacillus subtilis, Saccaromyces cerevisiae и др. микроор­ганизмы, которые могут секретировать целевой продукт в культуральную жидкость. Преимуществом Esherichia coli по сравнению с этими микроорганизмами считают то, что синтезируемые кишеч­ной палочкой чужеродные белки депонируются внутри клеток в виде белковых тел (так называемых Dense bodies) и недоступны для действия протеаз, от которых нет защиты у других вышеуказанны) продуцентов. Применение Esherichia coli в качестве промышленной штамма также целесообразно благодаря наиболее низкому уровни опасности для персонала и окружающей среды, что достигается обеспечением фильтрами всех линий, через которые происходят газовые выбросы из ферментеров, и термической стерилизацией всех стоков содержащих биоматериал.

Схема получения рекомбинантного инсулина по «Eli Lilly» (США)

• Химический синтез генов, кодирующих образование цепей А и I в определенной последовательности нуклеотидов.

• Конструирование вектора.

— Введение каждого синтетического гена в плазмиду: в одну — ген синтезирующий цепь А, в другую — ген, синтезирующий цепь В

— Для интенсивной репликации плазмид в каждую из ни: вводят также ген, кодирующий образование фермент β-галактозидазы.

• Введение полученных плазмид в клетку Escherichia coli с после­дующим получением двух культур продуцента, одна из которых синтезирует цепь А, а другая цепь В.

• Культуры помещают в ферментер, в культуральную среду добав­ляют галактозу, которая индуцирует образование фермента β-галактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются и в результате получается большое количество генов, синтезирую­щих цепи А и В.

• Клетки лизируют, выделяют цепи А и В, которые обрабатывают бромцианом для отщепления от них β-галактозидазы.

• Затем следует очистка и выделение А и В-цепей.

• Далее окисляют остатки цистеина и соединяют цепи А и В.

Полученный генно-инженерный человеческий инсулин не вызы­вает аллергических реакций, так как он видоспецифичен, и если в нем находят какие-либо недопустимые примеси в виде эндотоксинов и пирогенов, то это относится только к нарушениям в технологии его изготовления и культуры производства.