ЗАДАЧА 16

В современной биотехнологии при создании ЛС особое место отводится генной инженерии, суть технологии которой заключается…

Вариант ответа

Цели генной инженерии — создание новых продуцентов целевых продуктов (новые ЛС, диагностические и профилактические пре­параты).

Суть технологии — соединение фрагментов ДНК in vitro с последу­ющим введением изолированной ДНК в живую клетку посредством ферментов эндонуклеаз, в частности рестриктаз.

Техника генно-инженерного эксперимента.

• Получение чужеродного фрагмента ДНК для последующей встав­ки его в клетку хозяина.

• Выделение плазм иды из клетки-донора (например, Е. coli).

• Конструирование рекомбинантной плазмиды (вектора). Вектор-рекомбинант (плазм ида в виде фага или изолированной ДНК, или вируса) получают с помощью фермента рестриктазы, раз­резающей фосфодиэфирные связи в строго определенном месте последовательности оснований нуклеотидной цепи (сайт узна­вания). При этом образуется два липких конца. Далее следует стадия отжига — процесс смещения двух фрагментов ДНК, при котором восстанавливаются только водородные связи. Для восстановления фосфодиэфирных связей используют ферменты ДНК-лигазы, которые «сшивают, склеивают» молекулы ДНК.

• Включение вектора в клетку хозяина. Вектор включается в клетку хозяина при условии, если цитоплазматическая мембрана близ­ко подходит к клеточной стенке, тогда вектор проникает внутрь клетки через так называемые окошечки, которые образуются при обработке ее ферментами, в результате чего эта клетка становится компетентной.

• Отбор гибридных клонов. Проводят посев на питательную среду, содержащую, например, антибиотик бензилпенициллин. Приэтом вырастают только клоны, имеющие в своем геноме ген-маркер, кодирующий синтез, например, фермента β-лактамазы. Ген-маркер заранее внедряется в геном гибридной плазмиды. В процессе образования молекулы мРНК имеет место процесс сплайсинга (сращивания). У эукариот, в отличие от прокариот, ген представляет собой мозаичную структуру, содержащую наряду с экзонами (последовательности оснований, несущие информацию) интроны (последовательности оснований, не несущие информацию). Однако фермент РНК-полимераза катализирует транскрипцию как экзонов, так и интронов. В процессе сплайсинга у эукариот интроны с помощью ферментов вырезаются, а экзоны после удаления интро­нов сращиваются. При этом образуется функционирующая (зрелая) мРНК. У прокариот нет такого процесса (так как их гены не содер­жат интроны), и образующаяся в результате транскрипции молекула мРНК сразу же способна к функционированию.