С – концентрация в моль/л

Молекулярно-абсорбционный анализ

Приступим к рассмотрению молекулярно-абсорбционного метода анализа.

Привычно его называют фотометрический анализили фотометрия растворов. Надо отметить, что в настоящее время это 50 % аналитики (всего химического анализа), а в некоторых сферах деятельности, например в медицине, эта цифра доходит до 80 % в среднем, а если рассматривать биохимический анализ, то это 99 % пока реального определения факторов. Фотометрический анализ основан на поглощении излучения веществом.

Перед вами спектр излучения: гамма лучи до 10 нм, жесткое рентгеновское излучение от 10 до 100 нм, УФ излучение – 100-300 нм, видимое 300-700 нм и ближняя инфракрасная область от 700 до 900 нм (далее идет инфракрасная спектроскопия, радиочастоты и методы анализа основанные на них).

Рис 14. Спектр излучения

Молекулярно-абсорбционный анализ осуществляется в УФ- области, в видимой области - 400-700 нм, иногда выше - до 800 нм (внешняя инфракрасная область).

Спектры молекул, в отличие от спектров атомов, состоят из очень большого числа линий, которые группируются в полосы (полосатые спектры), а иногда и из широких сплошных спектральных участков (сплошные молекулярные спектры).

Полная энергия молекул обычно представляется как сумма электронной (Е_е), колебательной (Е_v) и вращательной (Е_г)

Е = Е_е + Е_v + Е_г (1)

Все виды энергии квантованы, при этом колебательные кванты меньше электронных, а вращательные - меньше колебательных, т.е.

Е_е > Е_v > Е_г.

Для получения спектров поглощения надо на вещество направить излучение, энергия фотонов которого соответствует энергии, необходимой для возбуждения того или иного вида внутренней энергии. Получение электронных спектров осуществляется ближним ультрафиолетовым или видимым излучением, колебательные спектры требуют ближних инфракрасных квантов, а вращательные - дальнего инфракрасного излучения. Это служит качественной характеристикой вещества.

Количественная характеристика связана с интенсивностью поглощения излучения веществом, или с интенсивностью окраски вещества, так как визуально чем сильнее окрашено вещество, тем сильнее оно поглощает излучение в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера.

По используемому оборудованию фотометрию делят на три раздела:

- визуальная фотометрия

- фотоэлектроколориметрия

- спектрофотометрия.

Приборы в фотометрии состоят из пяти основных узлов:

- стабильного источника излучения

- монохроматора – устройства, позволяющего выделить определенную длину волны излучения

- кюветы или пробирки

- детектора или преобразователя энергии излучения в электрический сигнал

- индикатора сигнала.

Визуальная фотометрия основана на визуальной оценке интенсивности окраски анализируемого вещества.

В данной разновидности фотометрии отсутствует монохроматор, в качестве детектора используется глаз и в качестве преобразователя – мозг.

В классическом варианте визуальная фотометрия осуществляется следующим образом: готовят серию растворов с кратностью концентрацией от 1 до 10 и готовят фоновый раствор, не содержащий определяемого вещества. Далее в тех же условиях готовят анализируемую пробу.

В хорошо освещенном месте в специальном штативе ставят 11 пробирок с 10 эталонными растворами и фоном или сравнивают окраску пробы с интенсивностью окраски эталонов, таким образом удается полуколичественное определение концентрации с точностью 10-30 %.

Рис. 15. Шкала интенсивности окраски

Такая схема работы применяется все реже, потому что теперь имеются приборы, позволяющие строже сравнивать интенсивность окраски анализируемого раствора с эталоном.

В визуальной фотометрии находит применение колориметр Дюбоска, сравнивающий окраску исследуемого раствора с эталонным в круглой кювете с помощью прозрачного стеклянного подвижного стержня. Тогда, если D_x = D_ст , то e l_x C_x = e l_ст C_ст , откуда С_х = С_ст (2) .

Наибольшее значение визуальная фотометрия имеет в другом варианте – это вариант экспресс-анализа (для полевых условий, для получения предварительных результатов анализов в лабораториях и т.д.).

К наиболее важной сфере распространения визуальной фотометрии можно отнести: оборона – диагностика оружия массового уничтожения (на военной кафедре индикаторные трубки, с их помощью полуколичественно можно определить концентрацию ряда токсических веществ).

В экологии применяется другой вариант визуальной фотометрии. Для работающих в загрязненной зоне к одежде пришивают специальные полоски, пропитанные солью свинца. Если в воздухе зоны есть сульфиды или сероводород, то эти полоски, по мере нахождения человека в этой зоне, окрашиваются с большей или меньшей интенсивностью. Это служит основанием для дополнительной оплаты.

Такие же системы устанавливаются в других местах, чтобы отследить общее количество токсичных паров.

Однако наиболее широкая сфера применения визуальной фотометрии – это медицина. Кстати, полоски для определения рН в биологических жидкостях – это тоже визуальная фотометрия.

Перед Вами несколько наборов полосок для контроля состава мочи: a-уротест - для определения белка, уротест – 2 для обнаружения глюкозы и белка, глюкоуротест - глюкоза в моче, уротест-3 – глюкоза и белок, кетоуротест – для обнаружения кетоновых тел в моче.

В закрытой упаковке с пробкой есть полоска. На ней наклеена чувствительная зона. При попадании капли мочи она окрашивается в определенный цвет. Есть еще и шкала, позволяющая сравнить и обнаружить наличие патологий. Эти наборы выпускают в больших количествах и используют в медицине для предварительной экспресс-диагностики.

Наиболее интересный набор для определения паров алкоголя. Он содержит трубки, мешочек, и индивидуальные мундштуки. В мешочек вдуваются пары алкоголя. В трубке находится активная зона - бихромат и серная кислота, дающие реакцию н алкоголь. На трубке есть красная черта, и если окраска изменяется выше черты, то так можно лишиться прав. Основной потребитель – это службы ГАИ, медицина, службы автохозяйства и индивидуальные водители.

Следующей разновидностью молекулярно-абсорбционного метода является фотоэлектроколориметрия

Фотоколориметрия основана на применении фотэлектороколориметров:

Рис. 16. Принципиальная схема устройства фотоэлектроколориметра

1 – источник видимого излучения; 2 – экран со щель;

3 – светофильтр; 4 – кювета с анализируемым раствором,

5 – фотоэлемент; 6 – фотоэлектронный усилитель,

7- стрелочный прибор.

В настоящее время выпускают фотоэлектроколориметры марок КФК-24, КФК-3 с компьютерными приставками. Шкала прибора отградуирована в единицах пропускания света, либо в единицах оптической плотности.

В приборе происходит сравнение окраски фонового раствора и анализируемого раствора. Связь между светопропусканием и оптической плотностью выражается законом Бугера Ламберта-Бера

D=lgI_о/I = eCl (3) ,

где I_о – интенсивность падающего света

I - интенсивность пропускаемого света

e – коэффициент молярного светопоглощения.

С – концентрация в моль/л

l – длина поглощающего слоя в см.

Все эти величины имеют размеры, но eCl – величина безразмерная.

Это уравнение является основой для количественного анализа. Величины e табулированы, l – измерены (размер указан на кювете).

Основным методом работы в фотометрии является метод калибровочного графика, который весьма стабилен в течение значительного промежутка времени.

Следующий вариант – спектрофотометрия.

Основан на использовании приборов другого типа – спектрофотометров имеющих монохроматическую систему призм.

Рис. 17. Принципиальная схема устройства спектрофотометра.

1 – источник излучения, 2 – экран со щелью, 3 – монохроматор- треугольная стеклянная призма, 4 – кювета с анализируемым раствором,

5 – фотоэлемент; 6 – фотоэлектронный усилитель,

7- стрелочный прибор.

Надо отметить что, спектры поглощения растворами веществ сильно различаются. Рассмотрим спектр поглощения пикрат – иона.

Рис. 18.. Спектр поглощения пикрат – иона

О структуре этого спектра: отдельные линии в нем размыты – они, практически, сливаются.

Поглощение пикрат-иона состоит из двух слившихся линий. Если их разделить, то одна будет при длине волны 358 нм, а другая - на 400 нм. Но различия между ними небольшое, и поэтому они сливаются.

Несколько слов о причине такого слияния. В растворах энергетика частиц (в данном случае, ионов пикрата) может существенно отличаться в зависимости от их сольватации, в данном случае гидратации.

Различный уровень гидратации приводит к смещению полосы спектра поглощения многих известных веществ, приведенных в специальной справочной литературе. Они могут служить для идентификации природы вещества. Спектры позволяют провести качественный анализ вещества, но основная задача - это получение количественных характеристик вещества. Зависимость оптической плотности от концентрации обычно линейна в широком диапазоне, и заранее построенный градуировочный график позволяет провести количественное определение вещества.

Спектр – система удобная для идентификации вещества. В справочной литературе приведены длины волн максимального поглощения различных веществ. Это тоже серьезная качественная характеристика, которая может быть использована для анализа веществ. Однако снятие спектра с использованием спектрофотометров необходимо не только для качественного, но и для количественного анализа. Количество веществ, которые надо анализировать, велико. Не всегда спектры этих веществ есть в литературе. Поэтому с использованием спектрофотометра снимаются спектры, а далее выделяется та длина волны, на которой определяется оптическая плотность вещества.

Выбор длины волны является важной составляющей успешного анализа, и вот почему. Обычно стараются работать на max поглощения вещества. В этом случае можно достичь наиболее низких пределов обнаружения, то есть появляется возможность анализировать более низкие концентрации веществ. Это вытекает из уравнения Бугера-Ламберта-Бера.

Нетрудно показать, что С_min, будет определять D_min, которую прибор может измерить более или менее точно.

Продифференцировав уравнение D = e l C, получим:

или (4)

Следовательно, коэффициент молярного поглощения равен тангенсу угла наклона градутровочной прямой. С его увеличением повышается чувствительность, поэтому наибольшее ее значение соответствует e_max.

С_min= D_min/el_max (5)

Надо отметить, что D_min, где еще возможна точная аналитика на уровне 0,05. l_max – это длина поглощающего слоя, в обычном случае длина кюветы. Длиннее чем 5 см, ее сделать трудно, и все приборы рассчитаны на такую максимальную длину кюветы.

В последнее время применяется специальная техника – лазерная фотометрия, где используются тонкие стеклянные капилляры, заполненные анализируемой пробой, через которую пропускается луч света. Длина таких капилляров может достигать сотни метров, и естественно, в этом случае l_max не 5 см, а 100 м, но это уникальная техника, и она редко используется.

Таким образом, подводя черту под сказанным, получим C_min=0.01/e, отсюда очевидно, что чем больше e, тем меньшую концентрацию можно анализировать.

Для начала назовем некоторые цифры: максимальное значение e для одной хромоформной группы в молекуле вещества находится на уровне – 100000 – 200000 (теоретически 180000). Но это уникальные величины, а 100000 часто встречаются. Существуют приемы увеличения e на одну молекулу определяемого вещества. Во-первых, это случай умножающихся реакций. Во-вторых, это случай умножения хромофорных групп. Это координация одного определяемого атома со многими молекулами хромофора (до 10). В этом случае e увеличивается по сравнению с одноцентровым хромофором до 1000000 и более.

Тем не менее, эти данные позволяют найти С_min, которое можно определять в обычных условиях методами молекулярно-абсорбционного анализа. Это уровень 10^-7 %. Отсюда вытекает, что чем больше e, тем будет чувствительнее анализ. Поэтому, имея спектр, можно выбрать максимальную длину волны, на которой осуществляется определение оптической плотности.

Рассмотрим рисунок, который наглядно показывает зависимость наклона градуировочного графика от величины λ_max на спектре поглощения. Чем больше этот максимум, тем круче градуировочный график, тем чувствительнее определение.

-

Рис.19. Зависимость чувствительности определения от