Ход работы. Приготовление питательной среды и подготовка посуды, их стерилизация.Для каждого конкретного микроорганизма можно назвать несколько вариантов сред

Приготовление питательной среды и подготовка посуды, их стерилизация.Для каждого конкретного микроорганизма можно назвать несколько вариантов сред, которые обеспечивают его рост и образование тех или других ферментов (табл. 3).

В лабораторной работе студент готовит 0,7 дм³ питательной среды, проведя предварительный пересчет величины навески каждого компонента среды на 700 см³ среды. Первоначально на технических весах взвешивается стакан, а затем поочередно в этот стакан отвешиваются все необходимые компоненты среды. Жидкие компоненты среды отмериваются по объему или отвешиваются отдельно.

Соли растворяются без особых предосторожностей. Крахмал или мука обычно смешиваются в соотношении 1:10 с холодной водой и при постоянном помешивании завариваются на кипящей водяной бане. Количество добавляемой воды рассчитывается с учетом всех жидких компонентов среды.

Прежде чем готовить среду, следует убедиться, что ясна последовательность смешивания ее отдельных компонентов, иначе, выполнив трудоемкую работу по взвешиванию, можно не получить хорошей среды.

Приготовление, смешивание и разваривание питательной среды осуществляются в эмалированной емкости на 1,5-20 дм³.

Приготовленную питательную среду после охлаждения до 40-45º С при помешивании отмеряют и заливают в специальные конические колбы на 750 см³, предназначенные для культивирования микроорганизмов на качалках. Для каждого варианта берут по четыре колбы, в каждую наливают по 120 см³ приготовленной среды (в зависимости от продуцента объем среды может быть иной). Колбы закрывают ватными пробками, пробки прикрывают бумажными плотными колпаками, чтобы они не увлажнялись при стерилизации. Одновременно с качалочными колбами на стерилизацию ставят колбу с 50 см³ среды для последующего определения ее pH. Кроме того, стерилизуют завернутые в бумагу 4 (одна из них запасная) пипетки на 2 см³, закрытые с широкого конца ватными тампонами (стерилизацию пипеток можно проводить в металлических пеналах сразу для всей группы) и 2 пробирки (одна запасная) с 10 см³ водопроводной воды, также закрытые ватными пробками и бумажными колпачками. Стерилизацию проводят в автоклаве в течение 30 минут при 120º С.

Таблица 3 – Составы питательных сред

Примечание: 1. Соли KH₂PO₄, MgSO₄, KCl, FeSO₄, NaNO₃ – среда Чапека. 2. В скобках дано содержание компонентов в среде для Asp. awamori – 16.

Определение pH среды.pH среды определяют электрометрическим методом дважды: до и после стерилизации.

Характеристика исходного состава среды.Чтобы проследить потребление из среды ее компонентов, необходимо знать их исходное содержание в среде. Здесь могут контролироваться самые различные соединения. Например, при биосинтезе амилаз важно знать характер потребления крахмала и других углеводов из среды, при биосинтезе целлюлаз – целлюлозы, пектиназ – пектиновых веществ и т.д. Кроме того, в исходной среде определяют содержание аминного и общего азота, фосфора. Перечень определяемых компонентов среды оговаривается в каждом индивидуальном задании.

Засев питательной среды.После того, как стерилизация окончена и автоклав открыт, пипетки помещают на 10-15 минут в горячий сушильный шкаф (температура 70-80º С) для подсушивания бумаги, колбы и остальную посуду оставляют в автоклаве на 15-20 минут с тем, чтобы бумажные колпачки подсохли в токе горячего воздуха. Затем колбы с питательной средой вынимают, и, если позволяет время, оставляют на столе для охлаждения их до температуры 30-35º С, если же времени нет, колбы можно поместить в ванную с холодной водой, но так, чтобы не намокли пробки, и после охлаждения насухо вытереть и снять бумажные колпачки.

Засев питательной среды проводят в боксе. Бокс перед посевом в течении 2-3 часов облучают бактерицидной лампой. Готовясь к посеву, ставят на стол штатив с пробирками посевной культуры и стерильной воды, пустой высокой стакан для грязных пипеток, 4 стерильные градуированные пипетки на 2 см² или пенал с пипетками, колбы со стерильной средой и горелку.

Засев желательно вести вдвоем. Один из студентов садиться напротив горелки, слева стоит второй студент. Первый студент берет в руки две пробирки: в левую - пробирку с продуцентом, в правую – со стерильной водой. Мизинцем левой руки захватывает пробку пробирки со стерильной водой и обжигает верхний край пробирки. Затем мизинцем правой руки открывает пробирку с культурой и содержимое первой пробирки выливает в пробирку с чистой культурой. После этого обе пробирки закрывают. Пустую пробирку из под воды, закрытую пробкой, ставят в штатив. Вторую пробирку с культурой и водой помещают между ладонями вертикально и плавно вращают в течении 2-3 минут, затем ставят пробирку в штатив. Первый же студент освобождает стерильную пипетку от бумаги в непосредственной близости от пламени горелки, держа ее верхний край в правой руке. Берет пробирку с суспензией конидий, открывает ее и, обжигая на огне края пробирки и пипетки, вводит пипетку в пробирку. Содержимое пробирки осторожно перемешивает, отбирая 2 см² посевной суспензии, закрывает пробирку пробкой и ставит ее в штатив. В это время второй студент, участвующий в посеве, открывает колбу со средой, обжигая горлышко и пробку, подводит край колбы под пипетку. Содержимое пипетки выливает в колбу, колбу закрывает пробкой, и ее содержимое тщательно перемешивает вращательными движениями. Грязную пипетку ставит нижним концом в стакан. Затем, используя имеющуюся конидиевую суспензию, второй стерильной пипеткой засевает среду во второй колбе и в третьей.

Четвертую колбу со средой центрифугируют для определения твердой фазы среды. Надосадочную жидкость декантируют, содержимое центрифужного стакана переносят в бокс в 10 см³ 10 %-ного раствора этилового спирта и высушивают до постоянной массы в сушильном шкафу.

По окончании засева пробки колб накрывают марлевыми салфетками и закрепляют резинками. Это необходимо для того, чтобы предохранить пробки от загрязнения и укрепить их при качании.

Характеристика условий культивирования.Колбы устанавливают на качалку и закрепляют удерживающим диском или же в специальных держателях. Качалка работает непрерывно в течении требуемого для роста культуры времени с частотой качаний 180-200 мин^-1, температура культивирования обычно 30º С. Для поддержания такой температуры в качальную комнату подают стерильный подогретый воздух (2-3 объема воздуха на объем качалочной комнаты за сутки).

Протокол наблюдений по первому занятию представлен в таблице 4.

Отделение биомассы гриба и твердой фазы среды.В колбах, снятых с качалки объем готовой культуры всегда немного меньше объема исходной среды, так как влага во время стерилизации и культивирования испаряется через ватную пробку. Естественная убыль составляет около 6-9%.

Чтобы определить количество образовавшейся биомассы, заранее подготавливают и высушивают до постоянной массы два бумажных фильтра для воронки Бюхнера. Содержимое двух колб поочередно фильтруют под вакуумом через воронку Бюхнера. Если в колбах остается на стенках взвесь, ее можно смыть фильтратом, возвращая его в колбу. Осадки следует слегка обсушить на фильтре и затем вместе с фильтром высушить до постоянной массы.

Содержимое третьей колбы фильтруют через обычный фильтр или через четыре слоя марли. В полученном осадке определяют активность ферментов. Биомасса микроскопических грибов обычно легко отделяется, после фильтрации ее просто снять с фильтра или с марли. После отделения осадков на каждый вариант опыта имеются три пробы фильтрата. В фильтрате каждой колбы определяют активность ферментов и содержание в нем некоторых веществ (азота, фосфора и т.д.).

Таблица 4 – Результаты анализов

Продуцент__________________________

Состав среды _______________________________

Определение количества сухой массы мицелия гриба.Фильтры вместе с осадками из первой и второй колб помещают в предварительно взвешенные донышки чашек Петри и высушивают в ИК сушильном шкафу до постоянной массы в течение 15-30 мин.

Можно вести высушивание до постоянной массы и в обычном сушильном шкафу при 105º С или даже в приборе Чижовой. После охлаждения фильтра в эксикаторе его взвешивают и определяют содержание сухой массы мицелия гриба.

Расчет количества биомассы Бм проводиться по формуле Бм =Д-(А+В+С)/1,2, где Д – масса фильтра с биомассой, помещенных в чашку Петри, после высушивания, г; А – масса сухого фильтра, г; В – масса донышка чашки Петри, г; С – масса твердой взвеси в питательной среде, г; 1,2 – коэффициент пересчета на 100 см³ культуральной жидкости. Расчет проводится без учета выпаренной влаги при стерилизации и культивировании.

Примечание: такой расчет биомассы можно вести в том случае, если известно, что твердые включения в среду не потребляются в процессе роста микроорганизма. Обычно такой расчет невозможен, если микроорганизм синтезирует ферменты, разрушающие целлюлозу и гемицеллюлозы.

Характеристика фильтрата культуральной жидкости.Прежде всего, в фильтрате определяют pH, затем все те компоненты культуральной жидкости, которые анализировали в исходной среде. На анализ надо брать пробы большего объема, так как основная часть этих соединений потреблена микроорганизмом в процессе роста.

Приготовление вытяжки из мицелия гриба.Мицелий из третьей колбы после отделения жидкой части культуральной жидкости промывают двумя порциями (по 20-25 см³) холодной воды (2-3º С) и переносят в фарфоровую ступку, где тщательно растирают в течении 10-15 минут с кварцевым песком (добавляют приблизительно 0,2-0,3 г кварцевого песка) и дистиллированной воды температурой 30º С. Количество воды должно быть около 30 см³. Затем содержимое ступки переносят в мерную колбу на 20 см³, настаивают 15-20 минут, охлаждают до 20º С и доводят дистиллированной водой до метки. В результате этих операций извлекаются ферменты, оставшиеся в мицелии, что дает возможность определить сумму всех ферментов, синтезированных микроорганизмом за весь цикл культивирования.

Содержимое мерной колбы тщательно перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат используют для определения активностей ферментов.

Определение активности ферментов в фильтрате культуральной жидкости и в мицелиальной массе гриба.Анализ ведется в зависимости от вида выбранного продуцента и синтезируемого им комплекса ферментов. Активности ферментов определяют в фильтратах культуральной жидкости и в биомассе микроорганизма. Так как, в мицелии обычно находится очень мало фермента, то на определение берут в 5-10 раз больше вытяжки, чем при анализе фильтрата культуральной жидкости.

Ферментальные активности (ФА), полученные в фильтрате культуральной жидкости и в вытяжке из мицелия, выражаются в соответствующих единицах на 1 см³ культуральной жидкости: суммой единиц ФА во всем объеме фильтрата культуральной жидкости (объем составляет 120*0,93 см³, где 0,93 – коэффициент, учитывающий условно все виды потерь и сухой остаток); в соответствующих единицах на 1 см³ вытяжки из мицелия; в единицах на весь объем (50 см³) вытяжки из мицелия (сумма ФА мицелия); в единицах на 1 г мицелия (для этого сумма единиц ФА мицелия делится на количество сухой массы микроорганизма во всем объеме).

Расчет продуцирующей способности гриба.Обычно в научно-исследовательских работах по физиологии микроорганизмов проводится показатель продуцирующей способности биомассы (Пс) того или другого микроорганизма. Пс – это то количество единиц активности ферментов, которое при данных условиях способен синтезировать 1 г биомассы микроорганизма (в пересчете на сухую массу).

Чтобы рассчитать Пс, необходимо знать сумму единиц ФА во всем мицелии (сумма ФА мицелия); сумма единиц Фа во всем объеме фильтрата культуральной жидкости (сумма ФА фильтрата); сухую массу мицелия (в г) во всем объеме: Пс = (сумма ФА мицелия + сумма ФА фильтрата): сумма Бм.

Кроме того, подсчитывается процентное содержание ферментативной активности в фильтрате культуральной жидкости и в мицелии по отношению к общей сумме единиц ферментативной активности в культуре (сумма ФА культуры).

Результаты всех определений и расчетов заполняются в свободную таблицу протоколов наблюдения.

Протокол наблюдений второй части лабораторной работы имеет вид:

Таблица 5 – Результаты исследований

Продуцент _________________________________

Состав среды _____________________________________

Условия культивирования: объем среды _____ см³; объем качалочной колбы _____ см³; температура культивирования _____ градусов; частота выращивания качалки ______ мин^-1 и т.д.

Работа заканчивается подробными выводами.

Контрольные вопросы

1 Сущность глубинного культивирования и его виды.

2 Устройство лабораторного ферментёра.

3 Методики работы.

а Приготовление питательных сред.

б Засев питательной среды.

в Отделение биомассы.

г Определение количества сухой массы мицелия гриба.

д Определение активности ферментов.