Количественное определение общего азота по методу Къельдаля

Наиболее распространенным методом определения общего азота в биологическом материале является метод Къельдаля. Основное его достоинство заключается в том, что он позволяет определить суммарный азот с высокой точностью. Несмотря на ряд модификаций, которые претерпел метод за свою историю, он, сохранив специфичность, стал стандартным методом определения азота. Однако из-за того, что отдельные участки его трудно поддаются автоматизации, метод и в настоящее время остается довольно трудоемким и длительным.

Принцип действия. При определении общего азота по Къельдалю органическое вещество минерализуют при высокой температуре концентрированной серной кислотой. При этом органическое вещество окисляется в присутствии катализатора до СО₂ и Н₂О, а весь азот переходит в аммиак и связывается с серной кислотой, образуя сульфат аммония:

Азотосодержащее [О]

органическое (NН₄)₂SО₄ +СО₂ + Н₂О

соединение Н₂SO₄

Раствором щелочи нейтрализуют избыток серной кислоты и высвобождают из сернистого аммония аммиак:

(NН₄)₂SО₄ + 2NаОН Nа₂SО₄ + 2 NН₃ + 2 Н₂О,

который затем отгоняется с парами воды и улавливается стандартным раствором борной кислоты.

При взаимодействии аммиака и кислоты образуется борат аммония NН₄Н₂ВО₃:

NН₃ +Н₃ВО₃ NН₄⁺ + Н₂ВО₃^-

Борат титруют стандартным раствором серной кислоты, причем избыток Н₃ВО₃ не мешает определению:

Н⁺ + Н₂ВО₃^- Н₃ВО_3.

Отгон аммиака давлением водяных паров и титрование ведут на приборе конструкции В.М. Сереньева (см. рисунок 2), где можно совместить две заключительные стадии с целью ускорения определения азота.

Используемые для сжигания исследуемого материала катализаторы должны содержать сернокислый калий для повышения температуры сжигания вещества до оптимального значения.

Из-за трудоемкости процедуры выделения белка в анализируемой практике часто определяют так называемый сырой белок (сырой протеин), используя данные по содержанию общего азота (белкового и небелкового), считая его условно белковым. Так как содержание азота в белках колеблется в довольно широких пределах, а в среднем составляет 16 %, то для пересчета азота на белок часто берут усредненный коэффициент – 6,25 (100:16 = 6,25). Этот коэффициент не является постоянным и в зависимости от содержания азота в белке у разных культур может изменяться от 5,3 до 6,25. Например, для пшеницы, ржи используют коэффициент 5,7 (100:17,5= 5,7). В целях получения сравнимых данных необходимо обязательно указывать коэффициент пересчета (N х коэффициент пересчета).

Ход работы. 0,3- 0,5 г исследуемого воздушно-сухого материала отвешивают в маленькой пробирке (0,5х3 см), которую затем вставляют в резиновую трубку нужного диаметра, и переносят в колбу Къельдаля, вводя пробирку почти до основания перевернутой вверх дном колбы и опрокидывая всю систему. По разности масс пробирки с навеской и пустой пробирки (после переноса) определяют массу навески для анализа. В колбу добавляют 0,5 ± 0,05 г смешанного катализатора и приливают цилиндром или дозатором 10 мл концентрированной Н₂SO₄. Перемешивают содержимое колбы (без встряхивания), закрывают ее стеклянной полой грушевидной втулкой или воронкой и ставят в наклонном положении (примерно 45 ⁰) в гнездо нагревателя в вытяжном шкафу. Колбу осторожно нагревают, снимая или уменьшая нагрев на некоторое время каждый раз, когда обугливаемое вещество начинает сильно пениться от выделяющихся газов, в том числе оксида серы (IV). После прекращения вспенивания можно усилить нагрев до слабого непрерывного кипения. Ввиду возможных потерь азота, вследствие разложения бисульфата аммония (сернокислый аммоний разлагается на аммиак и бисульфат при 355 ⁰С) необходимо следить, чтобы в процессе сжигания горло колбы всегда оставалось холодным, а также за тем, чтобы на стенках колбы не оставалось темных пятен, смывая их горячей кислотой, придав колбе наклонное положение. Когда содержимое колбы приобретает зеленовато-голубой цвет без желтого оттенка, ее кипятят еще около 20 минут, после чего в охлажденную на воздухе колбу добавляют небольшое количество воды для удаления следов кислоты со стеклянной втулки и внутренней стороны верхней части колбы, закрывают колбу резиновой пробкой или герметизируют другим способом и оставляют до определения азота. Отгон аммиака производят на приборе Сереньева (см. рисунок 2).

1-сосуд реакционный (реактор); 2- воронка; 3- барботер; 4- сосуд со щелочью; 5- бюретка; 6,7- спускные краны; 8- кран на свободный доступ воздуха; 9- ЛАТР.

Рисунок 2 – Прибор Сереньева для определения азота

Методика работы на приборе Сереньева. После заполнения бюретки титрованным раствором до нулевой отметки, подачи воды к водоструйному насосу и холодильнику барботера (7) и подключения электродов подготовленного к работе сосуда через ЛАТР (9) в сетьзакрывают краны в следующей последовательности: нижний барботера (7), затем верхний, сообщая барботер с реактором (8) и, наконец, кран реактора (6). В барботер (3) вносят из бюретки (5) примерно 1/4 часть (1-2 мл) предполагаемого для титрования стандартного раствора 0,02 н. серной кислоты, содержащей индикатор Гроака.

В реактор (1) через фиксированную воронку подают минерализованный образец, обеспечив полноту переноса и отсутствие следов кислоты на воронке дистиллированной водой. При этом следят за тем, чтобы объем перенесенной жидкости был как можно меньшим, поскольку в этом случае время анализа уменьшается. Осторожно добавляют 33 %-ный раствор гидроксида натрия до почернения смеси (работают в защитных очках).

Поступление аммиака с парами воды из реактора в барботер должно сопровождаться синхронным добавлением титрованного раствора (обеспечивается вручную) до границы перехода окраски в барботере с зеленой до лиловой (промежуточная окраска – сероватого тона). Постоянство лиловой окраски в течение 20–60 сек (временный интервал зависит от скорости отгонки) свидетельствует о конце титрования. В бюретке отмечают объем израсходованного стандартного раствора и показание заносят в лабораторный журнал.

При необходимости продолжить работу после очередного измерения (например, проведение холостого опыта после анализа испытуемого образца или наоборот), уменьшают нагрев, открывают краны, сообщая систему с атмосферой, в последовательности реактор - барботер (верхний кран (6,8)) – барботер (нижний кран (7)). После слива жидкости из барботера и реактора промывают фиксированную воронку последнего дистиллированной водой (до 50 мл). Затем краны закрывают в обратной последовательности, заполняют бюретку стандартным раствором – и прибор вновь готов к работе.

По окончании работы отключают ЛАТР, открывают кран реактора (6), затем верхний кран барботера (8). После истечения жидкости из реактора промывают фиксированную воронку водой, закрывают верхний кран барботера (8), затем кран реактора (6) и заполняют реактор водой. Вновь открывают краны, сообщая систему с атмосферой, в последовательности реактор – барботер (верхний кран (6,8)) – барботер (нижний кран (7)) – предохранительная склянка. Отключают насос и перекрывают водопроводную воду для охлаждения. После слива жидкости из реактора и барботера извлекают подвижную часть затвора (пробку) крана, промывают кран водой, просушивают, смазывают борным вазелином и собирают кран.

Расчет содержания азота на сухое вещество в исследуемом материале проводится по формуле:

V · 0,014 · n · k · 100 · 100

N = , (3)

g · (100 – W)

где N – содержание азота в пересчете на сухое вещество, %;

V - количество титрованного раствора 0,02 н Н₂SО₄, израсходованного на титрование за вычетом поправки на реактивы (контрольная проба), мл;

n – заданная нормальность титрованного раствора;

k - поправка на нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы, г;

W – влажность исследуемого вещества, %;

0,014 – титр1 н раствора серной кислоты по азоту, г/см³.

Расчет содержания азота на воздушно - сухое в исследуемом материале проводится по формуле:

V · 0,014 · n · k · 100

N = , (4)

g

где N – содержание азота в пересчете на воздушно-сухое вещество, %;

V– количество титрованного раствора, израсходованного на титрова- ние за вычетом поправки на реактивы (контрольная проба), мл;

n – заданная н - нормальность титрованного раствора;

k – поправка на н - нормальность титрованного раствора;

g – навеска анализируемой пробы, г;

0,014 – титр1 н раствора серной кислоты по азоту, г/ см³.

Содержание белка рассчитывают путем умножения полученных значений азота на соответствующий коэффициент пересчета.

Материалы и реактивы: зерно, мука, солод; концентрированный раствор серной кислоты; 33 % -ный раствор гидроксида натрия; смешанный индикатор Гроака (см. приложение Б, п.6); титрованный 0,02 н раствор серной кислоты с индикатором Гроака и борной кислотой (см. приложение Б, п.7); селеновый катализатор (см. приложение Б, п.8).

Оборудование: колбы Къельдаля; универсальная индикаторная бумага; цилиндры на 5, 10 мл; стеклянные втулки, воронки; пипетки на 20 мл; стаканы на 100 мл; промывалки; бумажные фильтры; пробирки с резиновой трубкой; прибор Сереньева для отгонки аммиака, защитные очки.