Бактериальные энтомопатогенные препараты

Потенциальными агентами в биологической защите растений являются более 90 видов бактерий, но лучшими микробными инсектицидами признаны препараты на основе Bacillus thuringiensis. К ним восприимчивы около 400 видов насекомых. К настоящему времени известно более 1000 штаммов B. thuringiensis, составляющих три патотипа: патотип А – патогены чешуекрылых (плодожорки, листовертки, шелкопряды, моли и др.), патотип В – патогены двукрылых (мошки, мухи, комары и др.), патотип С – патогены жесткокрылых (колорадский жук).

Биологическое действие бактериальных энтомопатогенных препаратов («энтомо» – насекомое) обеспечивается входящими в их состав спорами Bacillus thuringiensis, параспоральными кристаллами (d-эндотоксином), а также (намного реже) термостабильным b-экзотоксином. Обладают токсичным действием и соединения, синтезируемые клетками, проросшими из спор (дополнительный фактор вирулентности бактериальных инсектицидов). Образование помимо эндоспор параспоральных кристаллов является характерной особенностью кристаллоносных бактерий. В оболочках спор B. thuringiensis содержатся субъединицы d-эндотоксина, поэтому споры также оказывают токсичное действие на насекомых-мишеней, что одновременно способствует прорастанию спор.

Основным токсичным компонентом бактериальных инсектицидов является d-эндотоксин (кристаллический токсин), образующийся одновременно со спорой в противоположной части клетки (параспорально). После созревания спор и кристаллов клеточная стенка лизируется и оба образования (кристалл и спора) высвобождаются в культуральную среду.

Основу кристаллов d-эндотоксина составляют белковые субъединицы. Кроме белков в сотаве кристаллов обнаружены небольшие количества нуклеиновых кислот, сахаров и соединений фосфора (гликопептиды, фосфополипептиды), а также протеолитические ферменты.

Кристаллы штаммов B. thuringiensis содержат несколько видов токсичных для насекомых белков, представленных в различных соотношениях. Биохимия кристаллов изучена недостаточно.

Споры бактерий в высушенном состоянии могут сохраняться при комнатной температуре до 10 лет и более. При высокой влажности споры погибают при 100°С в течение 5–10 минут.

Споры бактерий, поглощенные восприимчивым насекомым, прорастают в его кишечнике. Вегетативные клетки проникают в полость тела, быстро размножаются, разрушая ткани. Эта стадия заражения получила название септицемии.

Белок кристалла растворяется в щелочной среде (рН 12–14) кишечника насекомого и трансформируется протеолитическими ферментами кишечника насекомого-мишени в действующий (активный) токсин. Специфичность действия эндотоксина определяется несколькими факторами: щелочной средой кишечника насекомого, составом белковых субъединиц кристалла и присутствием в кишечнике насекомого специфических протеолитических ферментов, активирующих прототоксин кристалла.

Молекулярная модель инсектицидного действия d-эндотоксина окончательно не разработана. Предложена гипотеза двухступенчатого действия d-эндотоксина: первый этап – связывание молекулы со специфическим рецептором на клеточной мембране, второй этап – образование пор в мембране диаметром 0,5–1,0 нм. Это приводит к дополнительному поступлению ионов в клетку, выходу из клетки молекул воды, но не макромолекул, следствием чего является коллоидно-осмотический лизис клеток кишечника насекомого-мишени.

Кристаллы d-эндотоксина термолабильны. Нагревание до 80–100°С в течение 30–40 мин разрушает структуру кристалла и инактивирует прототоксин.

b-Экзотоксин представляет собой структурный аналог АТФ, конкурирующий с АТФ за связывающий участок на некоторых ферментах. Он нарушает биосинтез РНК, действует как специфический ингибитор ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Токсическое действие b-экзотоксина на насекомых не является высокоспецифичным и проявляется медленнее, чем действие d-эндотоксина.

b-Экзотоксин – термостабильный, продуцируется во время вегетативного роста культуры и выделяется в культуральную среду. Для его накопления требуется определенный состав питательной среды. В культуральной жидкости накапливается до 120 мг/дм³ b-экзотоксина. У восприимчивых насекомых b-экзотоксин повреждает клетки кишечника, способствует проникновению бактерий в полости тела.

На основе B. thuringiensis в промышленных условиях получают ряд энтомопатогенных препаратов: бацитурин, энтобактерин, дендробациллин, инсектин и др. (табл. 10.1).

Таблица 10.1

Характеристика бактериальных препаратов

Технологические процессы получения энтомопатогенных препаратов различается разновидностью применяемых штаммов бактерий Bacillus thuringiensis и, следовательно, видом синтезируемых токсинов, условиями культивирования, титром накапливаемых в культуральной жидкости спор и кристаллов, способами концентрирования культуральной жидкости и формой выпускаемого препарата.

Первые промышленные препараты выпускали в виде сухого порошка – высушенный концентрат КЖ с наполнителем. Применяют эти препараты uлавным образом в виде водных суспензий (сухой дуст расходуется в большем количестве). Основные недостатки сухих препаратов:

– малая физическая стабильность рабочих суспензий;

– недостаточная смачиваемость листьев и прилипаемость;

– высокая чувствительность биоагента к воздействию солнечного света (УФ-лучи);

– ограниченный срок хранения.

Более совершенными товарными формами являются смачивающиеся порошки (включают различные добавки) и стабилизированные пасты.

В качестве добавок используют:

– консервант (хлорид натрия – 10–20%, хлороформ – 0,4–0,5%);

– наполнитель (каолин – 5–30%);

– прилипатель (карбоксиметилцеллюлоза или желатин, казеин – до 10%);

– смачиватель (поверхностно-активное вещество сульфанол – до 5%);

– стабилизатор суспензии (сульфитно-спиртовая барда – до 20%);

– защитные (от УФ-излучения) вещества (меласса, активированный уголь – 2–3%).

Для глубинного культивирования B. thuringiensis используют кукурузно-глюкозную (0,7% глюкозы, 4% кукурузного экстракта) и дрожжеполисахаридную (3% дрожжей, 1,5% кукурузной муки) среды.

Дрожжеполисахаридная среда (ДПС) обеспечивает более высокий титр клеток в КЖ, но имеет ряд недостатков:

– сильное вспенивание из-за большого количества дрожжей;

– наличие нерасщепленных дрожжевых клеток, затрудняющих сепарацию;

– низкий коэффициент использования питательных компонентов при высокой стоимости среды;

– высокое содержание аминного азота (900–1300 мг/дм³), приводящее к нарушению синхронности в развитии культуры, что увеличивает время ферментации (в конце ферментации много вегетативных клеток, в которых не сформировались споры).

Наиболее рациональным признано использование полусинтетических сред (табл. 10.2).

Полусинтетические среды имеют более низкую стоимость, чем ДПС, обеспечивают эффективный рост и синхронное развитие культуры.

Таблица 10.2

Полусинтетические среды для культивирования B. thuringiensis

Среды производственного состава используются при получении посевного материала на всех этапах накопления биомассы чистой культуры, начиная с качалочных колб. Исходную культуру рассевают и хранят в пробирках с мясо-пептонным агаром. Посевной материал накапливают в условиях асептики при температуре 30°С в течение 35–40 ч до образования спор. Величина рН питательной среды естественная (6,2–6,5), уровень аэрации 0,5 м³/(м³·мин). Количество посевного материала для засева производственной среды составляет около 0,0015% при титре 1,7·10⁹ спор в 1 см³.

Выращивание культуры в производственном ферментаторе проводят в течение 36–42 ч при тех же параметрах процесса, что и в посевном аппарате.

При нормальном ходе ферментации через 18–20 ч в клетках образуются хорошо просматриваемые под микроскопом споры и кристаллы. Процесс заканчивают при содержании в КЖ значительного количества свободных спор и кристаллов (не менее 10%). Готовую КЖ передают в предварительно простерилизованные сборники.

Процесс ферментации может быть реализован в непрерывно-циклическом режиме, который заключается в следующем: проводят периодическую ферментацию с соблюдением оптимальных параметров до рассыпания культуры на споры и кристаллы. При освобождении ферментатора в нем оставляют около 1% культуральной жидкости, которая выполняет роль посевного материала, и ферментацию повторяют без межцикловой подготовки ферментатора к работе. Основное требование – сохранить синхронность в развитии культуры. Для этого оставшийся в аппарате от предыдущей ферментации посевной материал подвергают тепловой обработке путем подачи первой порции питательной среды с температурой около 100°С. В результате вегетативные клетки и фаг инактивируются, а споры, выдержавшие тепловую обработку, служат посевным материалом для следующей операции. При таком способе ферментации оборот ферментатора значительно сокращается и составляет около 40 ч вместо 60 ч в периодическом режиме. Однако повторить процесс ферментации возможно не более 8–10 раз.

Для выделения спор и кристаллов из культуральной жидкости используют центрифугирование в бактофугах. Основной формой выпускаемых препаратов являются смачивающиеся порошки. Однако процесс сушки, помола, стандартизации и фасовки порошков является длительным и энергоемким. При применении препаратов необходимо готовить водные суспензии порошков, которые долго набухают, оседают на дно емкостей и забивают распыливающие устройства. В настоящее время более перспективной и экономически выгодной формой бактериальных препаратов считается стабилизированная паста. Получение ее проще и дешевле. Общая схема производства бактериальных препаратов выглядит следующим образом (рис. 10.1).

К концу ферментации рН среды повышается до 8,0–8,5. В щелочной среде кристаллы токсина могут дробиться на более мелкие, которые уносятся с фугатом при последующем центрифугировании. В связи с этим рН культуральной жидкости понижают до 6,0–6,2. В процессе центрифугирования происходит дальнейшее высвобождение спор и кристаллов из клеток (титр культуры в пасте должен составлять около 20 млрд. спор в 1 г). Полученную пасту выдерживают в сборнике при перемешивании в течение 30 мин и отбирают пробу для определения титра, вирулентности, наличия фага. При наличии большого количества спор, не освобожденных от клеточной оболочки, длительность выдержки при температуре 30°С увеличивают до 6 ч. Фугат может быть использован в 2–3 циклах для приготовления питательной среды (при длительном использовании фугата накапливаются вещества, тормозящие развитие культуры). Технологическая схема производства пастообразного продукта представлена на рис. 10.2.

Рис. 10.1. Общая схема получения бактериальных

энтомопатогенных препаратов

Препарат применяют путем опрыскивания растений 0,5–1,0%-ной водной суспензией в период активного питания вредителей. Исследования показали, что фугат может быть эффективно использован в составе питательной среды для культивирования кормовых дрожжей, которые в свою очередь являются компонентом среды для выращивания B. thuringiensis. Это обстоятельство свидетельствует о возможности создания малоотходного производства бактериальных препаратов при размещении его на территории дрожжевого завода.

Рис. 10.2. Технологическая схема получения бактериальных энтомопатогенных препаратов:

1 – емкость для приготовления питательной среды; 2 – фильтр сетчатый; 3 – нагревательная колонка; 4 – выдерживатель;

5 – холодильник; 6 – ферментатор; 7 – индивидуальный фильтр для очистки воздуха; 8 – циклон-каплеотделитель;

9 – сборник культуральной жидкости; 10 – бактофуга; 11 – сборник отработанной культуральной жидкости;

12 – сборник пасты