Заражение в полость амниона

Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Заражение в амниотическую полость проводят открытым или закрытым методом.

Техника открытого метода заражения:

1. Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию скорлупы в области тупого конца.

2. Над центром воздушного пространства в скорлупе ножницами вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике.

3. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую хорионаллантоисую оболочку.

4. Прорезают ножницами небольшое отверстие в хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки.

5. Удерживая амниотическую оболочку в этом положении, производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-0,2 мл разведения вируса.

6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, пользуясь для фиксации и герметизации яйца расплавленным парафином.

Заражённые эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток. Затем эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 4⁰С.

Техника вскрытия эмбриона при заражении в амниотическую полость:

1. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают скорлупу немного выше края воздушного мешка.

2. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость.

3. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и насасывают амниотическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У заражённого эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем как у нормального эмбриона она прозрачна.

4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку. 0,1-0,3 мл засевают в бульон для контроля на бактериологическую стерильность.

1.4. Культивирование вирусов путём заражения лабораторных животных

Восприимчивые к изучаемым вирусам животные называются экспериментальной моделью. Взятые в опыт животные должны быть одного вида, определённого возраста и содержаться в одинаковых условиях.

Таблица 2

Экспериментальные модели для некоторых вирусов

Для вирусологической работы чаще всего используют так называемые «чистые линии» экспериментальных животных. Они обладают однотипной наследственностью, имеют минимальное число латентных инфекций, обладают высокой восприимчивостью к вирусам. Особенно чувствительны к вирусам животные-гнотобионты. Работу животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. Все отходы и трупы погибших животных автоклавируют и сжигают.

Рис. 4. Лабораторное животное

При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных.

1.4.1. Интраназальное заражение

Метод используют для выделения пневмотропных вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом. Животных помещают в закрытую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. С помощью шприца или пастеровской пипетки в ноздри животного вводят 0,03-0,1 мл заражающего материала. За животными устанавливается наблюдение, при проявлении признаков заболевания мышей забивают при помощи эфирного наркоза, а затем вскрывают.

Этапы вскрытия животных:

1. Увлажнённый 5%-ным раствором лизола или фенола труп мыши фиксируют брюшком кверху на поверхности кюветы со смесью воска и парафина.

2. Обрабатывают кожные покровы спиртом, йодом и вновь спиртом; опаливают пламенем.

3. Ножницами делают продольный разрез кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам, отсепаровывают её.

4. Вскрывают грудную полость, вырезав грудину ножницами по рёберным хрящам.

5. Осматривают внешний вид органов грудной полости, обращая внимание на наличие экссудата. Извлекают лёгкие при строгом соблюдении асептики и сохраняют их при минусовой температуре в морозильнике до получения ответа на бактериологический контроль-результат посева кусочка легочной ткани в мясо-пептонный бульон (после выдерживания его в термостате при 37⁰С в течение суток).

6. При отрицательном контроле на бактериальную загрязнённость готовят 10%-ную суспензию легочной ткани путём растирания ткани в фарфоровой ступке, с постепенным добавлением физиологического раствора.

7. Суспензию центрифугируют для осаждения крупных частиц при 1500 об/мин, надосадочную жидкость собирают и используют для последующего вирусологического исследования.