Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.

При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток.

Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками (пенициллином и стрептомицином в концентрации 500-1000 Ед/мл) или в случае с простыми вирусами - эфиром для уничтожения посторонней микрофлоры (бактерий и грибов). Допустимым считается использование специальных антибактериальных фильтров или центрифугирование материала на невысокой скорости. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может служить:

1) развитие специфической дегенерации клеток - цитопатическое действие вируса (ЦПД;

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);

4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);

5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон - розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

По морфологическим изменениям в культуре клеток можновыделить несколько типов проявления ЦПД:

- полная дегенерация клеточного монослоя – изменения в большинстве клеток, их гибель и отделение от стекла, а отдельные живые клетки изменяют свою морфологию (пикноз ядра и цитоплазмы). Напр., вирусы полиомиелита, Коксаки, ЕСНО.

- частичная дегенерация – не характерно отслоение всех клеток от стекла.

- круглоклеточная дегенерация – образование скоплений больших округлых клеток, которые напоминают гроздья. Напр., аденовирусы.

- симпластообразование – образование многоядерных клеток (симпласты или синцитии).Напр., вирус кори, краснухи, эпидемического паротита, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус.

- пролиферативный тип изменений – вызывается онкогенными вирусами и проявляется формированием нескольких слоев клеток.

- образование внутриклеточных включений, которые могут локализоваться внутри ядра (аденовирусы) или в цитоплазме (тельца Бабеша-Негри)клетки. Их образование, форма, величина наличие в них вирусных нуклеиновых кислот являются важными признаками при проведении лаб. диагностики вирусных инфекций.