Студопедия

КАТЕГОРИИ:

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника



Скрининг с помощью ДНК-ДНК-гибридизации

Читайте также:
  1. II. Системы, развитие которых можно представить с помощью Универсальной Схемы Эволюции
  2. III. Решение логических задач с помощью рассуждений
  3. Lt;variant>возлагается. Эта обязанность состоит в том, что обвиняемому дозволяется обратиться за юридической помощью
  4. lt;variant>Эта обязанность состоит в том, что обвиняемому дозволяется обратиться за юридической помощью
  5. Автоматизированный перевод документов с помощью программы Promt
  6. Алгоритм 1.2. Выделение групп предприятий с помощью заливки контрастным цветом
  7. Алгоритм построения сокращенной ДНФ с помощью КНФ
  8. Анализ данных с помощью сводных таблиц
  9. Анализ электрических цепей с переменными элементами с помощью круговых диаграмм
  10. В таком виде данный метод активно применяется и поныне. Каждому хотя бы раз измеряли АД с помощью сфигмоманометра во время медицинских осмотров.

Клетки E.coli после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. Клетки из каждой выросшей колонии переносят на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр), так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чашке, затем лизируют и высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и фиксируют на фильтре. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят детекцию, чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из соответствующих клонов клетки и культивируют для выделения рекомбинантной ДНК.

Меченые ДНКзонды можно получить разными способами:

· методом концевого мечения с помощью полинуклеотидкиназы, осуществляющей присоединение dNTP, в котором в -положении по отношению к 5’-углероду дезоксирибозы встроен изотоп фосфора 32Р;

· методом ник-трансляции с помощью ДНК-полимеразы I;

· методом случайных праймеров, который основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров) в виде затравки для ДНК-полимеразы I (рис. 51). Они представляют собой набор гексануклеотидов, содержащий все возможные комбинации из четырех dNTP.

 

Рис. 50. Скрининг клонов трансформированных клеток E.coli с помощью гибридизации

 

При использовании методов “ник-трансляции” и “случайных праймеров” в суммарный пул dNTP, так называемых “холодных”, т.е. без метки, вводят один нуклеозидтрифосфот, чаще всего dATP, у которого из трех атомов фосфора - тот, который находится в α-положении по отношении к 5’-углероду дезоксирибозы, представлен изотопом 32Р или 33Р. При встраивании такого меченого субстрата в синтезируемую полинуклеотидную цепь, т.е. при образовании новой фосфодиэфирной связи, отщепляется пиррофосфат – атомы фосфора в γ- и β-положениях, а 32Р остается встроенным в сахарофосфатную цепь.

Рис. 51. Схема получения меченых ДНК-зондов с помощью метода “случайных праймеров”

 

Нерадиоактивные системы детекции используют ферментативное превращение хромогенного или хемолюминисцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяет окраску, а второй – испускает свет.



Последовательности нуклеотидов, которые могут служить ДНК-зондами

для скрининга геномной библиотеки можно получить, по крайней мере, двумя способами: использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд) либо получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена.

 


Дата добавления: 2015-04-16; просмотров: 29; Нарушение авторских прав


<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Создание геномных библиотек. Прокариоты | Иммунологический скрининг
lektsii.com - Лекции.Ком - 2014-2019 год. (0.01 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав
Главная страница Случайная страница Контакты