ББК 28.69

Федеральная программа книгоиздания России

Редакция литературы по биологии

От редактора перевода

Книга, которую вы держите в руках, — это превосходное руководство по молекулярной биотехнологии с подробным изложением ее принципов, методов и сфер применения. В ней обобщен многолетний опыт чтения лекций по этому предмету студентам разных специальностей одного из ведущих университетов Канады. До сих пор в нашей стране не было отечественных или переводных изданий, которые одновременно охватывали бы все разделы биотехнологии и все объекты, к которым приложимы биотехнологические методы: микроорганизмы, растения, животные, в том числе и человек. А между тем потребность в таком учебнике весьма велика, поскольку биотехнология входит в круг интересов представителей многих специальностей, имеющих разное базовое образование.

Учебник построен таким образом и написан таким языком, что им могут пользоваться студенты-биологи, химики и даже будущие врачи. По каждой теме даются ссылки на работы, в которых представлены оптимальные методики конструирования рекомбинантных организмов, исследования их функционирования, определения качества и количества целевых продуктов. Текст прерывается вставками, названными «Важная веха». Они представляют собой рефераты ключевых научных статей, которые действительно стали важными вехами в истории современной биотехнологии.

Книга состоит из четырех частей. В первой из них четко и ясно изложены основы молекулярной биологии, во второй речь идет о молекулярной биотехнологии микроорганизмов, в третьей — о биотехнологии эука-риотических систем, в том числе человека (молекулярная генетика человека и генная терапия). Особый интерес для российского читателя представляет четвертая часть, посвященная контролю и патентованию в области молекулярной биотехнологии. Эти вопросы почти не затрагиваются ни в учебниках, ни в образовательном процессе в нашей стране, хотя в биотехнологии, как и в любой прикладной науке, новые разработки дают дивиденды только в том случае, когда они защищены патентом. Авторы обсуждают законодательную базу использования генноинженерных продуктов в пищевой и фармацевтической промышленности, применения рекомбинантных организмов в сельском хозяйстве, нормативные акты, относящиеся к предварительным испытаниям этих организмов, требования, предъявляемые к ним при крупномасштабном применении. Детально рассматриваются правила патентования впервые секвениро-

6 От редактора перевода

ванных последовательностей ДНК, а также результатов биотехнологических разработок в случае многоклеточных организмов. Заключительный раздел посвящен юридическим аспектам генной терапии как соматических клеток, так и клеток зародышевой линии, клонирования целых организмов, в том числе и человека. Очень ценной является также информация об особенностях патентной практики в разных странах, что исключительно важно для продвижения отечественных генноинженерных продуктов на внешний рынок.

Книга чрезвычайно полезна как студентам разных специальностей, которым читается курс биотехнологии, так и специалистам-практикам.

Н. К. Янковский

Марике — с благодарностью за то, что она Марика

Б. Р. Г.

Лили — с благодарностью за всё

Дж. Дж. П.

Предисловие

За четыре года, прошедших со времени выхода в свет первого издания книги «Молекулярная биотехнология: принципы и применение", в области биотехнологии было сделано огромное количество открытий. На рынке появилось множество новых генноинженерных продуктов (например, вакцин и лекарственных препаратов). Рутинной практикой клинических лабораторий стало использование иммунологических методов диагностики и методов, основанных на применении по-лимеразной цепной реакции. Открыты и охарактеризованы многие гены, ассоциированные с различными заболеваниями человека, неизмеримо возрос объем клинических испытаний в области генной терапии. Построены подробные генетические и физические карты хромосом человека; впервые из дифференцированной соматической клетки клонировано жизнеспособное млекопитающее. Производство одного из трансгенных растений, сои, поставлено на коммерческую основу.

В первом издании мы описали принципы и применение молекулярной биотехнологии в широком биологическом контексте — в той форме, которая представлялась нам наиболее интересной и информативной. С тех пор мы получили много полезных замечаний от наших коллег, аспирантов и студентов из разных стран. Стараясь сохранить прежний подход и в то же время удовлетворить пожелания многих читателей, мы обновили, расширили и существенно переработали нашу книгу. Мы надеемся, что нам удалось передать ту волнующую атмосферу, в которой совершаются открытия в молекулярной биотехнологии, и в то же время ясно изложить ее основы, разъяснить смысл современных открытий и то, как их можно использовать для «производства товаров и услуг». В книге появилась новая глава, где рассмотрены микроорганизмы, обычно использующиеся в молекулярной биотехнологии. Кроме того, отдельная глава посвящена описанию основ молекулярной биологии. Значительно расширены главы по молекулярной генетике человека, генной терапии, биотехнологии растений, охватывающие самые последние достижения в этих областях. Пересмотрены главы, посвященные диагностическим системам и вакцинам. Кроме того, примерно в 1,5 раза увеличено число рисунков и таблиц, обновлен и расширен словарь терминов. Как мы надеемся, это позволит

8 Предисловие

лучше понять экспериментальные подходы и важные теоретические концепции. Несмотря на все эти изменения мы постарались сохранить стиль изложения — свободный от лабораторного жаргона и «дружелюбный по отношению к читателю" — сделавший первое издание книги столь популярным.

Мы очень признательны сотрудникам ASM Press, прежде всего Ken April, Susan Birch, Greg Payne, Jeff Holtmeier, за их постоянную помощь и поддержку, а также Susan Schmidler за превосходное, как всегда, оформление книги. Особая наша благодарность Ken April за неизменное внимание к рукописи и большое терпение в общении с нами.

Бернард Р. Глик

Джек Дж. Пастернак

Предисловие к первому изданию

Молекулярная биотехнология как новая область исследований сформировалась в конце 1970-х гг. на стыке технологии рекомбинантных ДНК и традиционной промышленной микробиологии. Современное общество неплохо осведомлено о проблемах молекулярной биотехнологии. Так или иначе об этой науке знают практически все. Кто-то видел фильм «Парк Юрского периода» с его потрясающими, искусно нарисованными, но совершенно несостоятельными с научной точки зрения «клонированными» динозаврами. Кто-то прочитал в газетах о том, что на рынке появились новые, «биотехнологические» помидоры с большим сроком хранения. А кто-то слышал рассуждения критически настроенного знатока о страшных последствиях генной инженерии, ожидающих нас в будущем. В этой книге мы попытаемся объяснить, что собой представляет эта научная дисциплина на самом деле, как проводятся биотехнологические исследования и как они могут повлиять на нашу жизнь.

Книга «Молекулярная биотехнология: принципы и применение» написана как учебник по биотехнологии, технологии рекомбинантных ДНК и генной инженерии. В ее основу положен курс лекций по биотехнологии, который мы читали на протяжении 12 лет студентам старших курсов и аспирантам биологических и инженерных специальностей Университета Ватерлоо. Книга предназначена для студентов, знакомых с основами биохимии, молекулярной генетики и микробиологии, хотя мы понимаем, что вряд ли они успели освоить все эти дисциплины до того, как начали заниматься биотехнологией. Поэтому, приступая к изложению той или иной темы, мы сначала рассматриваем ее основы и лишь затем переходим к деталям.

Главное внимание в книге уделено тому, как с помощью технологии рекомбинантных ДНК можно создавать нужные человеку продукты. Там, где это возможно, мы старались проиллюстрировать основные теоретические концепции конкретными результатами и методиками, уже применяющимися на практике. Из лавинообразного потока научных публикаций мы выбирали в качестве примеров те работы, которые не только иллюстрируют определенные положения, но и формируют у читателя твердую научную базу, позволяющую ему ориентироваться в узкоспециальных вопросах молекулярной биотехнологии. Конечно, мы понимаем, что эта область исследований развивается чрезвычайно быстро и некото-

10 Предисловие к первому изданию

рые из наших примеров могут оказаться устаревшими к тому времени, когда книга выйдет в свет.

Очень часто научные работники — неважно, о какой области науки идет речь, — в повседневном обшении, на конференциях, в ходе переписки используют специфическую терминологию, проще говоря, жаргон. Мы старались обойтись без него и во многих случаях намеренно давали словесное описание явления или процесса там, где, прибегая к лаконичному жаргону, мы могли бы сэкономить немало слов. Для описания одного и того же явления в любой области исследований существуют синонимы. Так, термины «технология рекомбинантных ДНК», «клонирование генов» и «генная инженерия» очень близки по смыслу. Когда в тексте впервые появлялся важный термин, мы давали в скобках его синоним или эквивалентное выражение. Освоить терминологию читателю поможет большой словарь терминов в конце книги.

Каждая глава завершается подробным резюме и списком вопросов для повторения. Мы надеемся, что это поможет усвоить прочитанное. Все ключевые идеи иллюстрируются тщательно подобранными цветными рисунками (всего их более 200); мы убеждены, что один рисунок может сказать больше, нежели тысяча слов. Гл. 1 знакомит читателя с основами молекулярной биотехнологии и некоторыми коммерческими аспектами, а следующие пять глав (гл. 2—6) — с ее методологией. Все вместе эти главы подготовят читателя к восприятию материала всех последующих глав. В гл. 7—12 части II рассмотрены способы получения ценных метаболитов, вакцин, лекарственных веществ и продуктов, использующихся для диагностики, а также методы биодеградации удобрений и пестицидов. В гл. 13 описаны способы крупномасштабного культивирования генетически измененных микроорганизмов с целью получения коммерческих продуктов. Часть. III посвящена молекулярной биотехнологии растений и животных (гл. 14 и 15). Гл. 16 и 17 знакомят читателя с применением технологии рекомбинантных ДНК для идентификации генов человека, ответственных за развитие некоторых заболеваний, и подходами к генной терапии. В последней, IV части рассмотрены вопросы регламентации исследований в области молекулярной биотехнологии, оформления патентов на различные продукты и изобретения.

В конце каждой главы есть список литературы. В нем могут содержаться ссылки, не упоминаемые в самой главе. Иногда мы давали выдержки из статей или представляли данные в собственном изложении. Разумеется, мы несем полную ответственность за все неточности или не совсем корректные трактовки, которые при этом могли возникнуть, хотя и надеемся, что нам удалось этого избежать. Списки литературы включают ссылки и на работы более общего характера, способствующие лучшему усвоению материала.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить всех, кто согласился прочитать различные разделы этой книги, когда она еще находилась в виде рукописи. Их советы и замечания очень помогли нам. Среди тех, кого нам хотелось бы упомянуть, — Arthur 1. Aronson, Purdue University; Ronald M. Atlas, University

Предисловие кпервому изданию 11

of Louisville; Fred Ausubel, Massachusetts General Hospital; David R. Benson, University of Connecticut; Jean E. Brenchley, Pennsylvania State University; A. M. Chakrabarty, University of Illinois at Chicago; Stan Gelvin, Purdue University; Janet H. Glaser. University of Illinois at Urbana-Champaign; David Gwynne, Cambridge NeuroScience; George D. Hegeman, Indiana University; James B. Kaper, University of Maryland at Baltimore; Donald R. Lightfoot, Eastern Washington University at Cheney and Spokane; Cynthia Moore, Washington University; William E. Newton, Virginia Polytechnic University; Danton H. O'Day, University of Toronto in Mississauga; Richard D. Palmiter, University of Washington; David H. Persing, Mayo Clinic; William S. Reznikoff, University of Wisconsin; Campbell W. Robinson, University of Waterloo; Marc Siegel, University of Waterloo; Aaron J. Shatkin, Center for Advanced Biotechnology and Medicine at Rutgers University; Jim Schwartz, Genentech; Daniel C. Stein, University of Maryland at College Park; Dean A. Stetler, University of Kansas; and Robert T. Vinopal, University of Connecticut.

Мы весьма признательны также сотрудникам ASM Press: Susan Birch, главному редактору; Rith Siega], менеджеру; Jodi Simpson, литературному редактору; Susan Schmidler, главному художнику; Peg Markow из Rüttle, Shaw & Wetherill, Inc., главному менеджеру проекта; художникам Network Graphics; и наконец, Patrick Fitzgerald, директору ASM Press, который всеми доступными способами помогал претворению нашего замысла в жизнь.

Бернард Р. Глик

Джек Дж. Пастернак

Часть I.
Основы молекулярной биотехнологии

Молекулярная биотехнология — это увлекательнейшая область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуществляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. В ч. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про- и эукариотических системах. И наконец, мы рассмотрим, как можно улучшить свойства конечных продуктов, модифицируя клонированные гены путем введения в них специфических нуклеотидных замен (мутагенез in vitro). В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии.

ГЛАВА 1.
Молекулярно-биотехнологическая
революция

Технология рекомбинантных ДНК

15 октября 1980 г. на Нью-Йоркской фондовой бирже произошло знаменательное событие: уже через 20 минут после начала торгов стоимость одной акции биотехнологической компании Genentech поднялась с 35 до 89 долларов. Это был рекордный для того времени скачок цен на акции коммерческого предприятия. К моменту закрытия торгов в тот день цена одной акции Genentech составляла 71,25 доллара, а стоимость всех 528 тысяч акций была столь баснословно высока, что мелкие инвесторы, собиравшиеся приобрести небольшой пакет акций, не имели никаких шансов.

По-видимому, это был первый случай в истории, когда о начале великой технологической революции возвестил биржевой колокол. В 1980 г., когда фирма Genentech впервые предложила обществу свои акции, это была небольшая компания в Калифорнии, в течение четырех лет успешно работавшая над проблемой получения рекомбинантных ДНК. За два года до этого ученым компании удалось выделить фрагменты гена (последовательности ДНК), кодирующие человеческий инсулин, и перенести их в генетические элементы (клонирующие векторы), способные реплицироваться в клетках обычной кишечной палочки (Escherichia coli). Эти бактериальные клетки работали как биологические фабрики по производству человеческого инсулина, который после соответствующей очистки мог использоваться как лекарственный препарат для больных диабетом, дающих аллергическую реакцию на свиной инсулин. Еще десять лет назад такое развитие событий представлялось нереальным, но сегодня все это стало вполне привычным.

Головокружительный взлет стоимости акций компании Genentech предопределялся как реальной оценкой потенциала технологии рекомбинантных ДНК, так и мечтами о будущих возможностях. Многие думали, что новая технология станет тем рогом изобилия XX века, который напоит и накормит всех желающих. Эти мечты подпитывались энтузиазмом газетных и журнальных публикаций и телевизионных репортажей, подогревались активностью биржевых брокеров и научно-фантастическими сюжетами. Воображение будоражили полчища удивительных микробов, растения и животные, созданные человеком. Энтузиасты предрекали, что генноинженерные микробы вытеснят химические удобрения, будут уничтожать разливы нефти; появятся растения с передающимися по наследству устойчивостью к вредителям и исключительно высокой питательной ценностью; будут созданы сельскохозяйственные животные, более эффективно усваивающие пищу, быстро прибавляющие в весе и дающие нежирное мясо. Казалось, что коль скоро конкретные биологические свойства обусловливаются одним или несколькими генами (единицами наследственности), создание организмов с новым генетическим устройством не составит труда. И в самом деле, хотя шумиха, поднятая вокруг новой технологии, была не совсем адекватной, увлечение этой идеей имело основания. Прошло немногим более пятнадцати лет, и многие наиболее разумные проекты стали реальностью. В своей книге мы расскажем о том, как это произошло и каковы перспективы применения технологии рекомбинантных ДНК.