ГЛАВА 18. Murphy D. J. 1996. Engineering oil production in rapeseed and other oil crops

Murphy D. J. 1996. Engineering oil production in rapeseed and other oil crops. Trends Biotechnol. 14:206-213.

Nawrath C., Y. Poirier, С. Somerville. 1994. Targeting of polyhydroxybutyrate biosynthetic pathway to the plastids of Arabtdopsts thaliana results in high levels of polymer accumulation. Proc. Nail. Acad. Sei. USA 91: L2760-12764.

Panarrubia L., R. Ют, J. Giovannoni, S.-H. Kim, R. L· Fischer. 1992. Production of the sweet protein monellin in transgenic plants. Bio/Technology 10: 561-564.

Perlak F. J., R. W. Deaton, T. A. Armstrong, R. L. Fuchs, S, R. Sims, J. T. Greenplate, D. A- Fischhoff. 1990. Insect resistant cotton plants. Bio/Technolog}'8: 939-943.

IVrlak l·. J., R. L Fuchs, D. A. Dean, S. L. McPherson, D. A. Fischhoff. 1991. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes. Proc. NatL Acad, Sei. USA 88: 3324-3328.

Powell P. A., D. M. Stark, P. R. Sanders, R. N. Beachy. 1989. Protection against tobacco mosaic virus in transgenic plants that express tobacco mosaic virus antisense RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 6949-6952.

Quinn J. P. 1990. Evolving strategies For the genetic engineering of herbicide resistance in plants. Biotechnol. Adv. 8: 321-333.

Rooijen G. J. H., M. M. Moloney. 1995. Plant seed oil-bodies as carriers for foreign proteins. Bio/Technology 13: 72-77.

Ryan C, A. 1990. Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses against insect and pathogens. Annu. Rev.Phytopathol 28: 425-449.

Sen Gupta A., R. P. Webb, A. S. Holaday, R. D. Allen. 1993. Overproduction of Superoxide dismutase protects plants from oxidative stress. Plant Physiol. 103: 1067-1073.

Shade R. E., H. E. Schroeder, J. J. Pueyo, L. M. Tabe, L. L. Murdock, T. J. V. Higgins, M. J. Chrispeels. 1994. Transgenic pea seeds expressing the tx-amylase inhibitor of the common bean are resistant to bruchid beetles. Bio/Technology 12: 793-796.

Shah D. M., C. M. T. Rommens, R. N. Beachy. 1995. Resistance to diseases and insects in transgenic plants: progress and applications to agriculture. Trends Bioiechnol. 13: 362-368.

Töpfer R., N. Martini, J. ScheU. 1995. Modification of plant lipid synthesis. Science 268:681—686.

Tricoli D. M., K. J. Carney, P. F. Russell, J. R. MeMaster, D. W. Groff, K. C. Hadden, P. T. Himmel, J. P. Hubbard, M. L. Boeshore, H. D. Quemada. 1995. Field evaluation of transgenic squash containing single or multiple virus coat protein gene constructs for resistance to cocumbcr mosaic virus, watermelon mosaic virus 2, and zucchini yellow mosaic virus. Bio/Technology 13: 1458-1465.

Vaeck M., A. Reynaerts, H. HOfte, S. Jansens, M. de Beuckeleer, C. Dean, M. Zabeau, M. Van Montagu, J. Leemans, 1987. Transgenic plants protected from insect attack. Nature 328: 33-37.

Van Camp W., H. WDtekens, C. Bmrter, M. Van Montagu, D. Inzé, P. Reupold-Popp, H. Sandermann, Jr., C. Langebartels. 1994. Elevated levels of Superoxide dismutase protect transgenic plants against ozone damage, Bio/Technology 12: 165-168.

Van Rie J. 1991. Insect control with transgenic plants: resistance proof? Trends Bioiechnol. 9: 177-179.

Vierheilig H., M. Alt, J.-M. Neuhaus, T. Boiler, A. Wiemken. 1993. Colonization of transgenic Nicotiana syivestris plants, expressing different forms of Nicotiana tabacum chitinase, by the root pathogen Khizoctonia solant and by the myeor-rhizal symbiont Glomus mosseae. Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 261-264.

Williams S., L. Friedrich, S. Dincher, N. Carozzi, H. Kessmann, E. Ward, J. Ryals. 1992. Chemical regulation of Bacillus thuringiensis 6-endotoxin expression in transgenic plants. Bio/Technology 10: 540-543.

Zhu Q., E. A. Mäher, S. Masoud, R. A. Dixon, С J. Lamb. 1994. Enhanced protection against fungal attack by constitutive co-expression of chitinase and glucanase genes in transgenic tobacco. Bio/Technology 12: 807-812.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Предположим, что растения инфицированы вирусом без оболочки с одноцепочечным РНК-геномом (8000 нуклеотидов). Вирус и его РНК. можно легко выделить. Кроме того,

Генная инженерия растений:применение 417

у вас есть антитела ко всем четырем вирусным белкам. Какую стратегию вы выбрали бы для защиты растений от вирусной инфекции?

2. Предложите несколько стратегий создания растений, устойчивых к насекомым-вредителям.

3. Как с помощью антисмысловой РНК можно обеспечить устойчивость растений к специфическим вирусам?

4. Каким образом ингибиторы протеиназ, ингибитор амилазы и холестеролоксидаза защищают растения от насекомых-вредителей?

5. Предложите стратегию защиты растений от повреждения несколькими разными вирусами.

6. Опишите основные способы создания растений, устойчивых к гербицидам.

7. Как следует изменить растение, чтобы обеспечить его защиту от патогенных почвеных грибов?

8. Как с помощью генной инженерии получить растения, устойчивые к патогенным бактериям?

9. Какой подход вы применили бы для создания растения, толерантного к высоким концентрациям солей?

10. Предположим, что вам нужно замедлить созревание плодов авокадо при их транспортировке. Какой способ вы выберете?

11. Как с помощью методов генной инженерии получить растения с необычной окраской цветков?

12. Как с помощью генной инженерии повысить содержание лизина в сое?

13. Что такое косупрессия? Антисмысловая супрессия? Сравните их.

14. Как упростить процедуру очистки растворимых белков, например фрагментов антител, синтезируемых растениями?

ГЛАВА 19.
Трансгенные животные

Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удойностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т. д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получать более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и отбора, требующая больших временных и материальных затрат, оказалась тем не менее исключительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения новых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора становится все труднее. Так, линия с новым «ценным" геном может нести также и «вредные» гены, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенными в том, что новая, улучшенная линия сохранит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно новую стратегию.

Успешные эксперименты по введению чужеродных генов в клетки млекопитающих и возможность создания генетически идентичных животных путем переноса ядра из эмбриональной клетки в яйцеклетку с удаленным ядром (перенос ядра, клонирование) позволили включать в хромосомную ДНК высших животных отдельные функциональные гены или целые их кластеры. Используемая стратегия состоит в следующем.

• Клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки.

• Инокулированные оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь (поскольку успешное завершение развития эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно).

• Отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках.

• Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.

Такой подход имеет много практических приложений. Например, если продукт вводимого гена стимулирует рост, то трансфицированные животные будут расти быстрее при меньшем количестве пищи. Повышение эффективности усвоения пищи всего на несколько процентов может существенно снизить стоимость конечного продукта (говядины, свинины и т. д.).

Идея генетического изменения животных путем введения генов в оплодотворенные яйцеклетки была реализована на практике в 1980-х гг. Как и во многих других новых областях науки, для упрощения обмена информацией между учеными был введен ряд новых терминов. Так, животное, чей генотип был изменен путем введения чужеродной (экзогенной) ДНК, было названо трансгенным, вводимая ДНК - трансгеном, а весь процесс -трансгенной технологией, или трансгенозом.

Эксперименты по генетической модификации многоклеточных организмов путем введения в них трансгенов требуют много времени. Тем не менее трансгеноз стал мощным инстру-

Трансгенные животные 419

ментом для исследования молекулярных основ экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модельных систем, позволяющих изучать болезни человека, а также для генетической модификации клеток молочных желез животных с целью получения с молоком важных для медицины белков. Был даже предложен новый термин «фарминг», относящийся к процессу получения из молока трансгенных домашних ("pharm") животных аутентичных белков человека или фармацевтических препаратов. Использование молока целесообразно потому, что оно образуется в организме животного в большом количестве и его можно надаивать по мере надобности без вреда для животного. Вырабатываемый молочной железой и секретируемый в молоко новый белок не должен при этом оказывать никаких побочных эффектов на нормальные физиологические процессы, протекающие в организме трансгенного животного, и подвергаться посттрансляционным изменениям, которые по крайней мере близки к таковым в клетках человека. Кроме того, его выделение из молока, которое содержит и другие белки (табл. 19.1), не должно составлять большого труда.

Трансгенные мыши: методология

Трансгенные технологии разрабатывались и совершенствовались на лабораторных мышах. С начала 1980-х гг. в различные линии мышей были введены сотни генов. Эти исследования в значительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухолей, природы иммунологической специфичности, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процессов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в создании трансгенных линий, позволяющих моделировать различные генетические болезни человека. Введение чужеродной ДНК мышам можно осуществить разными методами: 1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки; 3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.

Использование ретровирусных векторов

Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов (рис. 19.1), перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего транс ген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии.

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность.

420 ГЛАВА 19

Рис. 19.1. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион («суррогатные» матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мышат, несущих трансген в клетках зародышевой линии, проводят ряд скрещиваний.	Рис. 19.2. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций. Яйцеклетки выделяют из самок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской про нуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в «суррогатную» мать, которая производит на свет трансгенных мышат — основателей трансгенных линий.

Метод микроинъекции ДНК

В настоящее время для создания трансгенных мышей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следующем (рис. 19.2).

Трансгенные животные 421

1. Увеличение числа яйцеклеток, в которых будет инъецирована чужеродная ДНК, путем стимуляции гиперовуляции у самок-доноров. Сначала самкам вводят сыворотку беременной кобылы, а спустя примерно 48 ч -хорионичеcкий гонадотропин человека. В результате гиперовуляции образуется примерно 35 яйцеклеток вместо обычных 5—10.

2. Скрещивание с самцами самок с гиперовуляцией и их умерщвление. Вымывание из яйцеводов оплодотворенных яйцеклеток.

3. Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйцеклетки — как правило, сразу после выделения. Часто вводимая трансгенная конструкция находится в линейной форме и не содержит прока-риотических векторных последовательностей.

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (мужской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским пронуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно перемещать, ориентировать нужным образом и фиксировать. Опытный экспериментатор за день может инокулировать несколько сотен яйцеклеток.

После введения ДНК от 25 до 40 яйцеклеток имплантируют микрохирургическим путем в «суррогатную» мать, у которой вызывают ложную беременность скрещиванием с вазэктомированным самцом. У мышей спаривание — это единственный известный способ подготовки матки к имплантации. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйцеклеток «суррогатной» матери не оплодотворяется. Эмбрионы развиваются только из введенных яйцеклеток, и мышата рождаются спустя примерно 3 нед после имплантации.

Для идентификации трансгенных животных выделяют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий.

Описанный подход кажется на первый взгляд относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококвалифицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в лучшем случае лишь из 5% инокулированных яйцеклеток (рис. 19.3). Ни один из этапов эксперимента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необходимо использовать боль-

Рис. 19.3. Суммарная эффективность трансгеноза после микроинъекций. Все оплодотворенные яйцеклетки (100%) коровы, свиньи, овцы и мыши инокулировали трансгеном, однако успешная имплантация и появление потомства были редкими событиями: трансгенное потомство давали менее 5% обработанных яйцеклеток.

422 ГЛАВА 19

шое число оплодотворенных яйцеклеток. Например, при получении трансгенных мышей после инъекции ДНК выживают только 66% оплодотворенных яйцеклеток; мышата развиваются примерно из 25% имплантированных яйцеклеток, причем трансгенными из них оказываются лишь 25%. Таким образом, из 1000 имплантированных оплодотворенных яйцеклеток развивается от 30 до 50 трансгенных мышат. Кроме того, введенная ДНК может интегрировать в любое место в геноме, и зачастую множество ее копий включаются в один сайт. И наконец, не все трансгенные мышата будут обладать нужными свойствами. В организме некоторых особей трансген может не экспрессироваться из-за неподходящего окружения сайта интеграции, а в организме других число копий чужеродного гена может оказаться слишком большим, что может привести к гиперпродукции белка и нарушению нормальных физиологических процессов. И все же, несмотря на все это, метод микроинъекций используют для получения линий мышей, несущих функциональные трансгены, довольно часто.

Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES). ES-клет-ки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных (рис. 19.4). Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем.

При трансфекции ES-клеток в культуре вектором, предназначенным для интеграции в специфический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ES-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называемую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции клеток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт.

Сайт-мишень должен находиться в такой области геномной ДНК, которая не кодирует важных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансляцию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно.

Вектор для позитивно-негативной селекции обычно содержит следующие элементы: 1) два блока последовательностей (НВ1 и НВ2), гомологичных отдельным участкам сайта-мишени; 2) трансген (TG), кодирующий новую функцию реципиента; 3) последовательность, кодирующую устойчивость к соединению G-418 (Neo^r); 4) два разных гена тимидинкиназы (tkl и tk2) вируса простого герпеса типов 1 и 2 (HSV-rit/ и HSV-Î&2) (рис. 19.5, А). Ключевым для позитивно-негативной селекции является взаимное расположение этих элементов. Трансген и ген устойчивости к G-418 (Neo^r) должны находиться между двумя участками ДНК, гомологичными сайту-мишени, а гены HSV-tk1 и HSV-tk2 — по бокам этой конструкции. Если встраивание происходит в случайный сайт (не в НВ1 и НВ2), то с высокой вероятностью вместе с другими последовательностями интегрируют один или оба гена HSV-/& (рис. 19.5, А). Напротив, если интеграция происходит в результате гомологичной рекомбинации путем двойного кроссинговера в нужный сайт, то в геном встроятся только трансген и ген Neo^r, а гены HSV-/& — нет (рис. [9.5, 5). При выращивании трансфицирован-ных клеток в присутствии G-418 клетки, не несущие ген Neo^r, расти не будут. Выживут только клетки, в которых произошла интеграция -иными словами, осуществляется позитивная селекция. Если одновременно с G-418 в среду

Трансгенные животные 423

Рис. 19.4. Получение трансгенных мышей с помощью генетической мо­дификации эмбриональных стволо­вых (ES) клеток. ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бла-стоцисты мыши. Их трансфицируют вектором, несущим трансген, куль­тивируют и идентифицируют транс-фицированные клетки методом по­зитивно-негативной селекции или ПЦР. Популяцию трансфицирован-ных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты, которые затем имплантируют в матку «суррогатных» матерей. Скрещивая животных-ос­нователей, несущих трансген в клет­ках зародышевой линии, можно по­лучить линии трансгенных мышей.

424 ГЛАВА 19

Рис. 19.5. Позитивно-негативная селекция. А. Неспецифическая интеграция. В хромосому встроились оба гена тимидинкиназы (tk1 и tk2), два участка ДНК, гомологичные специфичным последовательностям хромосомной ДНК репипиентных клеток (НВ1 и НВ2), ген (Neo r), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому соединению G-418, и трансген (TG). После трансфекции проводят тестирование клеток на устойчивость к G-418 и ганцикловиру, который становится цититоксичным для клеток, синтезирующих тимидинкиназу. Интеграция может произойти и по-другому, со встраиванием в хромосому только гена тимидинкиназы. В присутствии G-418 и ганцикловира все такие клетки тоже погибают. Б. Специфическая интеграция с помощью гомологичной рекомбинации. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками (НВ1 и НВ2) векторной и хромосомной ДНК в последнюю встраивается фрагмент, не содержащий генов тимидинкиназы (tk1 и tk2). В присутствии G-418 и ганцикловира выживают только клетки, в которых прошла гомологичная рекомбинация.

добавить ганцикловир, то рост клеток, синтезирующих тимидинкиназу, будет подавлен, поскольку этот фермент катализирует превращение ганцикловира в токсичное соединение, летальное для клетки, т. е. произойдет негативная селекция. Клетки, прошедшие через такое двойное сито, скорее всего будут содержать последовательность, встроившуюся в нужный сайт. Хоть этот метод не застрахован от ошибок, он позволяет обогатить клеточную популяцию клетками, несущими трансген в специфичном хромосомном сайте.

Более простой способ идентификации ES-клеток, несущих трансген в нужном сайте, основан на использовании ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последовательности, отсутствующей в геноме мыши (рис. 19.6). После трансфекции ES-клеток этим вектором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров (Р1) комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) нуклеотидной последовательности интегрировавшего вектора, а второй (Р2) — участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт

Трансгенныеживотные 425

Рис. 19.6. Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР. А. В результате неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужного размера при амплификации не образуется. Р1 гибридизуется с уникальным участком (US) встроенной ДНК, отсутствующим в хромосомной ДНК клетки-реципиента. Б. В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ1 и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы CS1 и CS2, с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые находятся на определенном расстоянии друг от друга. В ходе ПЦР-амплификации синтезируются фрагменты одного размера, которые можно идентифицировать при помощи гель-электрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит транс ген (TG), находящийся между гомологичными участками (НВ1 и НВ2), встроился в определенный сайт хромосомы.

ожидаемый продукт амплификации образовываться не будет (рис. 19.6, А), а при сайт-специфической интеграции в результате ПЦР-амплификации образуется фрагмент ДНК известного размера (рис. 19.6, Б). Таким образом можно идентифицировать пулы ES-клеток, содержащих трансген в нужном сайте, а пересевая клетки из этих пулов — получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой.

ES-клетки, в геном которых в нужном сайте встроен трансген, можно культивировать и ввести в эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать такие эмбрионы в матку псевдобеременных «суррогатных» матерей. Мышата, у которых генетически модифицированные ES-клетки участвовали в образовании клеток зародышевой линии, могут дать начало трансгенным линиям. Для этого их нужно скрестить с особями той же линии, а затем скрестить их трансгенных потомков. В результате будут получены трансгенные мыши, гомозиготные по трансгену.

В специфический хромосомный сайт ES-клеток можно не только встроить трансген, кодирующий какую-то новую функцию, но и направленно разрушить этот сайт интеграцией с его кодирующей областью специфической последовательности (обычно селективного маркерного гена) (рис. 19.7). Одна из задач направленного нарушения («нокаута») гена состоит в исследовании влияния этого процесса на развитие организма и протекающие в нем физиологические процессы. Кроме того, есть надежда, что трансгенных животных с нарушением в определенном гене можно использовать как модель для изучения болезней человека на молекулярном уровне.

Например, направленный «нокаут» гена родопсина мыши приводит к инактивации палочек сетчатки, что имитирует такую болезнь человека, как пигментный ретинит. На мышах с «нокаутированным» геном родопсина можно изучать процесс дегенерации сетчатки, а также

426 ГЛАВА 19

терапевтический эффект лекарственных средств, замедляющих или вообще останавливающих генетически обусловленный патологический процесс. Уже создано более 250 линий мышей с «нокаутированными» генами, использующихся в качестве моделей для изучения различных заболеваний человека.

В принципе подходы к созданию трансгенных животных с «улучшенными функциями» и с «потерей функций» сходны. К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные таковым у мышей, пока не обнаружены у крупного рогатого скота, овей, свиней и цыплят, но их поиск продолжается.

Рис. 19.7. «Нокаут» гена с помощью направленной гомологичной рекомбинации. Вектор несет селективны и маркерный ген (smg) и фланкирующие его последовательности, гомологичные соответствующим участкам гена-мишени. Последний содержит пять экзонов (1—5). В результате гомологичной рекомбинации (штриховые линии) ген-мишень прерывается («нокаутируется»).

Клонирование с помощью переноса ядра

Плюрипотентность можно выявить, если перенести ядро тестируемой клетки в яйцеклетку с удаленным ядром и затем исследовать способность последней к развитию и образованию жизнеспособного потомства. В нескольких лабораториях с переменным успехом исследовали плюрипотентность линий эмбриональных клеток, клеток плода и взрослой особи. Было показано, что ядра эмбриональных клеток способны -хотя и с низкой эффективностью — обеспечивать развитие. Например, с помощью переноса ядер эмбриональных клеток крупного рогатого скота, культивированных непродолжительное время, были получены жизнеспособные особи. Всем известная овца по имени Долли была клонирована с помощью переноса ядра клетки молочной железы (вымени) взрослого животного (рис. 19.8). Так впервые была доказана плюрипотентность ядра дифференцированной взрослой клетки. Впрочем, нельзя исключить, что на самом деле донорское ядро было взято из недифференцированной клетки, присутствовавшей в эпителии молочной железы организма-донора.

Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G₀), и. возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. Дело в том, что в течение первых трех делений зиготы овцы, занимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связываются с инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки.

Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание трансгенных животных с помощью метода переноса ядер стало реальным, — это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. Если это удастся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных организмов станет почти рутинной процедурой. Однако вследствие видовых различий во времени процесса деления

Трансгенные животные 427

Рис. 19.8. Клонирование овцы методом переноса ядра. Ядро яйцеклетки удаляют с помощью микропипетки. Культивируют эпителиальные клетки молочной железы взрослой особи и индуцируют их переход в фазу G0. Осуществляют слияние клеток в G0-фазе и яйцеклеток, лишенных ядра, и выращивают восстановленные яйцеклетки в культуре или в яйцеводе с наложенной лигатурой до ранних стадий эмбриогенеза, а затем имплантируют их в матку «суррогатной» матери, где и происходит дальнейшее развитие. В эксперименте, описанном Уилмутом и др. (Wilmut et al., 1997), было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе G0; из 29 эмбрионов только один развился до жизнеспособного плода.

428 ГЛАВА 19

Генетическая трансформация эмбрионов мыши микроинъекцией очищенной ДНК

J. W. Gordon, G. A. Scangos, D. J, Plotkin, J. A. Barbosa. F. H. Ruddle Proc. Nuit, Acad, Sei. USA 77: 7380-7384, 1980

Экспрессия гена тимидинкиназы вируса простою герпеса в соматических клетках мыши после инъекции рекимбинантною гена в яйцеклетки

R. L. Brinster, H. Y. Chen, M. Trumbauer, A, W. Senear, R. Warren, R. D. Palmiter Cell 27: 223-231, 1981

клетки на ранних стадиях эмбриогенеза и инициации транскрипции в этот период пока не ясно, удастся ли осуществить перенос ядра в случае каких-либо других домашних животных, кроме овец, если донорское ядро будет находится на той же стадии, что и яйцеклетка.

Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом

Большинство трансгенов представляют собой кДНК, небольшие гены (<20 т, п. н.) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (>100 т. п. н.) слишком велики для встраивания в обычные векторы. Учитывая все это, для трансгеноза стали использовать искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), вмещающие фрагменты геномной ДНК длиной от 100 до > 1000 т. п. н.

Трансгенных мышей получали микроинъекцией в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки или трансфекцией ES-клеток с помощью YAC,несущих несколько родственных генов или один большой ген. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти функциональных генов ß-глобина человека суммарной длиной примерно 250 т. п. н., экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время — точно так же, как это происходит у человека. Такое соответст-

Трансгенныеживотные 429

вне обеспечивалось фланкирующими их последовательностями, которые содержат промотор и другие важные регуляторные элементы.

Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, — это примечательный пример трансгеноза с помощью YAC. Как отмечалось в гл. 10, моноклональные антитела можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить человеческие моноклональные антитела практически невозможно. К сожалению, и моноклональные антитела грызунов иммуногенны для человека. Чтобы «очеловечить» существующие моноклональные антитела грызунов, были разработаны сложные стратегии с использованием рекомбинантных ДНК. В результате этих трудоемких процедур удалось получить Fv- и Fab-фрагменты, зачастую обладающие каким-то сродством к специфическому антигену. Возможно, технологического прорыва удастся достичь, если использовать для получения полноразмерных человеческих антител более доступный метод с использованием гибридом.

Синтез природных антител — это настоящее чудо. Антитело — очень сложная тетрамерная конструкция, состоящая из двух пар разных цепей. Одна из них называется тяжелой (H), a другая — легкой (λ или к). Эти термины отражают различия в молекулярных массах субъединиц антитела. Генетические особенности каждой тяжелой цепи определяются комбинацией вариабельного (V_H), дивергентного (D_H), шарнирного (J_H) и константного (С_н) участков (доменов) соматической ДНК в B-клетке. Известны два типа легких цепей, λ и к, которые образуются в результате перестройки их собственных вариабельных (νλ, Vk), шарнирных (Jλ, Jk) и константных (Cλ, Ск) доменов. Данная В-клетка синтезирует один вид антител, с уникальной комбинацией участков, составляющих Η-цепь, и либо перестроенной λ-, либо к-цепью.

Набор генетических элементов, обеспечивающих образование множества разных Н-цепей антител человека, включает около 95 V_H-доменов, 30 D_н-доменов, 6 J_н-доменов и 5 основных константных (Сa, Сγ, Сδ, Сε, Cμ) доменов. Ло-кус к-генов содержит примерно 76 Vк-доменов, 5 Jк-доменов и один константный (Ск) участок (рис. 19.9). Размер Н-локусов и к-генов — от 1 до 1,5 т. п. н. Для создания трансгенных мышей, способных синтезировать множество различных человеческих антител, необходимо инактивироватъ мышиные гены Н- и L-цепей, а затем встроить в хромосомную ДНК мыши YAC, содержащую гены Н- и L-цепей каждого человеческого гена иммуноглобулина,

Чтобы решить эту задачу, мышиные гены Н-и к-цепей были заменены («нокаутированы») небольшим участком кластера генов Η-цепи человека (который включал 4 V_н-домена, 16 D_H-доменов, 6 Д_н-доменов, Сγ и Cμ) и кластера генов к-цепи человека (содержащего 4 Vк-домена, 5 Jк-доменов и Ск). Трансгенные мыши с таким набором генов антител человека синтезировали человеческие антитела к некоторым антигенам; кроме того, были созданы гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела. Однако разнообразие человеческих антител, продуцируемых такими трансгенными мышами, было невелико вследствие ограниченности набора вариабельных сегментов Н- и к-цепей. Чтобы решить эту проблему, создали YAC с большим числом генов вариабельных участков Н- и к-цепей гемоглобина человека.

Объединив четыре разные YAC с генами Н-цепей гемоглобина человека, создали YAC длиной 1000 т. п. н., несущую 66 V_н-доменов, около 30 D_н-сегментов, 6 J_н-доменов, C, Сδ, и Сγ. Аналогично, из трех YAC, несущих различные домены vk, создали YAC длиной 800 т. п. н. с 32 vk-доменами, 5 JK-доменами и Ск. ES-клетки трансфицировали по отдельности YAC с генами Н- и к-цепей методом слияния клеток, отобрали клетки, в которых произошла интеграция YAC, с помощью селективного маркера и проверили целостность каждой вставки методом ПЦР. Инъецировали клетки, несущие встроенные гены Н- либо к-цепи, в бластоцисты и идентифицировали особь-основателя с помощью ПЦР. Трансгенных мышей со вставками генов Н- и к-цепей скрещивали по отдельности с мышами с инактивированными локусами этих цепей. Затем потомство скрещивали между собой, чтобы получить мышей, лишенных функциональных мышиных генов Н- и к-цепей, но несущих обе вставки генов Н- и к-цепей гемоглобина человека,

Трансгенные мыши с увеличенным числом человеческих V_H- и Vк-доменов синтезировали

430 ГЛАВА 19

Рис. 19.9. Схематичное изображение генов к- и Η-цепей иммуноглобулинов человека. А. Строение гена к-цепи иммуноглобулина в клетках зародышевой линии. Штриховая линия — промежуточные домены, здесь не показанные. Ген функциональной к-цепи, например Vк8-Jк4-Ск, образуется в B-клетках в результате нескольких перестроек соответствующих ДНК- доменов. Представленная здесь комбинация — лишь одна из 500 возможных. Б. Строение гена Η-цепи иммуноглобулина в клетках зародышевой линии. Штриховая линия — промежуточные домены, здесь не показанные. Ген функциональной Η-цепи, например VH33-DH26-JH4-C образуется в B-клетках в результате ряда перестроек соответствующих доменов. Представленная здесь комбинация — лишь одна из 140 000 возможных. На рисунке показан только один Сγ-домен, хотя на самом деле их четыре (Cγl, Сγ2а, Сγ2b и Сγ3).

человеческие антитела. Их иммунизировали тремя разными антигенами, и в каждом случае гибридомы секретировали человеческие моноклональные антитела, обладаюшие высоким сродством к антигену, которым животные были иммунизированы. Весьма вероятно, что с помощью такой трансгенной системы удастся получать человеческие моноклональные антитела для использования их в медицине.

Трансгенные мыши: применение

Трансгенные мыши могут служить модельными системами для изучения болезней человека и тест-системами для исследования возможности синтеза продуктов, представляющих интерес для медицины. Используя целых животных, можно моделировать и возникновение патологии, и ее развитие. Однако мышь — не человек, хотя она тоже относится к классу млекопитающих, поэтому данные, полученные на трансгенных моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в том, что касается медицинских аспектов. Тем не менее в некоторых случаях они позволяют выявить ключевые моменты этиологии сложной болезни. Принимая во внимание все это, ученые разработали «мышиные» модели таких генетических болезней человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образование опухолей, гипертония, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной системы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие.

Болезнь Альцгеймера — это дегенеративный процесс, приводящий к утрате клеток различных отделов головного мозга. Наиболее ранним проявлением служит ухудшение памяти. Этот процесс прогрессирует, к нему присоединяются утрата способности к абстрактному мышлению, изменение личности, нарушения речи, снижение физического статуса. Патология наблюдается у 1% людей возрастной группы от 60 до 65 лет и у 30% людей старше 80 лет. При патоморфологическом исследовании в теле нейронов обнаруживаются нейрофибриллярные клубочки, а у синаптических окончаний — плотные агрегаты, называемые сенильными бляшками (рис. 19.10). Кроме того, в кровеносных сосудах мозга обнаруживаются конгломераты — амилоидные бляшки,

Основным компонентом сенильных и амилоидных бляшек является белок Aß (амилоид β, ß-белок, ß-амилоидный белок, β/Α4) мол. массой 4 кДа. Существуют Aß-белки с разным числом аминокислотных остатков, например Αβ40 и Αβ42. Все они образуются в результате протео-

Трансгенные животные 431

Рис, 19.10, Схематическое изображение нейрона коры головного мозга человека с указанием некоторых гистологических особенностей, характерных для болезни Альцгеймера. У синапсов образуются сенильные бляшки, содержащие амилоидные скопления и обломки клеток, В геле нейрона накапливаются нейрофибриллы, включающие агрегаты из белков цитоскелета и других белков. Происходят и другие изменения, здесь не показанные.

литического расщепления белка-предшественника (АРР). Причины аккумуляции Aß-белка не установлены. Члены некоторых семей, в которых с высокой частотой встречается болезнь Альцгеймера, несут мутации в гене АРР, что наводит на мысль об участии этого гена в возникновении данной патологии. К сожалению, проследить в деталях за возникновением и развитием болезни Альцгеймера на человеке не удается. Неоценимую помощь в этом могла бы оказать какая-нибудь «животная» модель,

Было получено множество трансгенных мышей, несущих полноразмерный ген АРР или его часть под контролем нейроспецифичного промотора. При этом у большинства животных образование амилоидных бляшек, нейрофибриллярных клубочков, гибель нейронов или нарушение поведения не отмечались. Однако у животных, несущих трансген, кодирующий участок из 100 последних аминокислот АРР, который включал и Aß-белок, обнаруживалась дегенерация нервных тканей, аналогичная таковой при болезни Альцгеймера.

Более адекватные «животные» модели, позволяющие изучать болезнь Альцгеймера, были созданы с использованием трансгенов, содержащих мутации в гене АРР, характерные для некоторых семей с высокой частотой встречаемости болезни Альцгеймера в раннем возрасте (<50 лет), У одной группы таких семей в положении 717 АРР (АРР-717) вместо валина присутствовал фенилаланин, в другой группе в положениях 670 и 671 АРР (АРР-670/671) лизин и метионин были заменены на аспарагин и лейцин соответственно.

Трансген с мутацией АРР-717 был создан на основе кДНК АРР встраиванием между экзонами 6 и 7, 7 и 8, 8 и 9 модифицированных интронов. Интроны вводились потому, что, согласно данным эксперимента, содержащие их трансгены транскрибируются более эффективно, чем трансгены без интронов. Конструкция «кДНК АРР—интроны» находилась под контролем промотора гена ß-фактора роста из тромбоцитов, экспрессирующегося в тканях мозга (рис. 19.11). Вся она была названа мини-геном PDAPP. У стареющих трансгенных мышей (старше 6 месяцев), несущих около 40 копий PDAPP, образовывались амилоидные бляшки, отмечались гибель нейронов и дефекты памяти. Конструкция АРР-670/671 под контролем нейроспецифичного промотора вызывала у трансгенных мышей симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера, в том числе образование избыточных количеств Aß42. Интересно, что ни у стареющих мышей, несущих PDAPP-мини-ген, ни у трансгенных мышей АРР-670/671 нейрофибриллярные клубочки не обнаруживались. Возможно, эти структуры возникают у человека как следствие сверхпродукции Aß42,

В развитии болезни Альцгеймера у человека участвуют еще три гена — АроЕ4, гены пресенилина l (PS1) и пресенилина 2 (PS2). Наличие аллеля АроЕ4 локуса АроЕ, который ответствен за

432 ГЛАВА 19

Рис. 19.11. Генетическая конструкция, называемая мини-геном PDAPP, с помощью которой можно моделировать развитие болезни Альцгеймера утрансгенных мышей. 1—10 — экзоны кДНК белка-предшественника амилоида, А— С — введенные интроны. Регуляторными элементами являются промотор гена ß-фактора роста из тромбоцитов и сигнал полиаденилирования вируса SV40.

транспорт липидов, коррелирует с увеличением вероятности возникновения болезни Альцгеймера у людей старше 60 лет, В семьях, где отмечается развитие этой болезни в молодом возрасте, обнаруживаются мутации в генах пресенилинов, однако роль каждого из них в развитии данной патологии не выяснена. По данным разных авторов, мутации в генах пресенилинов приводят к увеличению аккумуляции Aß42. Например, у дважды трансгенных мышей, полученных скрещиванием трансгенных мышей, которые несли полноразмерный человеческий ген АРР, с мышами, несущими мутантный ген пресенилина 1, отмечалась сверхпродукция Aß42. Пока о патогенезе болезни Альцгеймера мало что известно, но есть надежда, что животные модели помогут ответить на некоторые важные вопросы о ее молекулярных основах. В США эта болезнь поражает ежегодно около 4 млн. человек, и наносимый ею ущерб составляет порядка 100 млрд. долларов.

Трансгенных мышей использовали также в качестве модельных систем для изучения экспрессии генов, кодирующих трансгенные продукты, которые секретируются в молоко. Так, для изучения функций белка, нарушения в котором приводят к муковисцидозу (CFTR), и для разработки подходов к лечению муковисцидоза (CF) необходимы большие количества аутентичного CFTR-белка.

Муковисцидоз — распространенная генетическая болезнь, поражающая в странах Европы одного из 2500 новорожденных. Первичный эффект дефектного CF-гена - это изменение функции CFTR, который в норме служит каналом для ионов хлора. В результате блокирования потока этих ионов в клетку и из клетки в протоках некоторых органов, особенно в легких и поджелудочной железе, скапливается слизь. Она становится источником бактериальной инфекции, которая с трудом поддается лечению антибиотиками. ДНК, высвобождающаяся из лизи-ровавших бактерий, делает слизь очень густой. Загустевшая слизь забивает протоки, нарушается нормальная работа органа и симптомы муковисцидоза еще более усиливаются. Продолжительность жизни больных муковисцидозом составляет в настоящее время 25-30 лет.

Для того чтобы лучше изучить механизм действия CFTR, необходимо иметь этот белок в достаточном количестве. Все известные клеточные системы экспрессии in vitro не обеспечивали его эффективного синтеза. Возможно, это связано с аккумуляцией CFTR в мембранах трансфицированных клеток. Решить эту проблему можно было бы постоянным удалением плазматических мембран из хозяйских клеток. В такой системе гетерологичный трансмембранный белок связывался бы с отдельными фрагментами плазматической мембраны, что значительно облегчало бы его концентрирование и очистку. Аналогичный механизм используется клетками молочной железы для образования глобул жира в период вскармливания. Жировые капельки инкапсулируются в плазматической мембране и в таком виде секретируются в молоко.

Чтобы проверить действенность этой системы, полноразмерную кДНК CFTR встроили в середину дефектного гена ß-казеина козы, из которого был удален участок от конца экзона 2 до начала экзона 7 (рис, 19.12). Получившаяся конструкция содержала промотор и сигнал терминации транскрипции гена ß-казеина козы. При этом кДНК CFTR была встроена в структурный ген с интронами, благодаря которым повышалась эффективность транскрипции трансгена. Ген ß-казеина активно экспрессируется в клетках молочных желез в период вскармливания, и этот белок является основным белком молока.

Трансгенныеживотные 433

Рис. 19.12, Генетическая конструкция «кДНК СFТG -ген ß-казеина козы». Πолноразмерная кДНК CFTR встроена между экзонами 2 (ЕХ2) и 7 (ЕХ7) гена ß-казеина козы. Сохранены промотор, терминатор и экзоны 1,8 и 9(ЕХ1, ЕХ8 и ЕХ9) гена казеина.

Были получены линии трансгенных мышей, несущих кДНК CFTR под контролем регуляторных последовательностей гена ß-казеина. Как и ожидалось, в молоке трансгенных самок содержался CFTR-белок, связанный с мембранами глобул жира. Никаких отрицательных побочных эффектов у кормящих CFTR-трансгенных самок или у мышат, вскормленных их молоком, не наблюдалось. CFTR был гликолизирован и легко экстрагировался из жировой фракции молока. Остается только выяснить, является ли он аутентичным белком. Исследовалась также возможность получения других мембраносвязан-ных белков с молоком. В клетках молочных желез трансгенных мышей в период лактации синтезируется множество белков, представляющих интерес для медицины. Но чтобы иметь возможность получать CFTR, другие трансмембранные белки и различные белки человека в больших количествах, соответствующие трансгенные конструкции необходимо встраивать в геном более крупных млекопитающих — коровы, овцы или козы.

Трансгенный крупный рогатый скот

Если предполагается использовать молочную железу в качестве «биореактора», то наиболее предпочтительным животным для трансгеноза является крупный рогатый скот, который ежегодно дает до 10 000 л молока, содержащего примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантно-го белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно 100 кг такого белка в год. По случайному совпадению, именно столько белка С, использующегося для предотвращения тромбообразования, требуется ежегодно. С другой стороны, одной трансгенной коровы будет более чем достаточно для получения требуемого ежегодно количества фактора IX (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови, который вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови.

Для создания трансгенных коров использовали модифицированную схему трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК (рис. 19.13). Процедура включала следующие основные этапы.

1. Сбор ооцитов коров, забитых на скотобойне.

2. Созревание ооцитов in vitro.

3. Оплодотворение бычьей спермой in vitro.

4. Центрифугирование оплодотворенных яйцеклеток для концентрирования желтка, который в нормальных яйцеклетках мешает визуализации мужского пронуклеуса с помощью секционного микроскопа.

5. Микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус.

6. Развитие эмбрионов in vitro.

7. Нехирургическая имплантация одного эмбриона реципиентной самке во время течки.

8. Скрининг ДНК потомков на наличие трансгена.

В тестовых экспериментах из пула в 2470 ооцитов были получены два трансгенных теленка. Этот результат указывает на результативность описанного подхода, но также и на его низкую эффективность. Исследования в этой области продолжаются, и есть надежда на усовершенствование методики трансгеноза. Например, скоро появится возможность отбирать небольшое число клеток у развивающегося эмбриона in vitro и тестировать их на наличие трансгена; такая потеря клеток эмбрионом не помешает его нормальному развитию. Этот тест позволит имплантировать только эмбрионы, несущие трансген.

Одна из целей трансгеноза крупного рогатого скота — изменение содержания в молоке различных компонентов. Так, количество сыра, получаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казеина, поэтому весьма

434 ГЛАВА 19

Рис. 19.13. Получение трансгенных коров.

перспективным представляется увеличение количества синтезируемого к-казеина с помощью гиперэкспрессии трансгена этого белка. Далее, если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках молочной железы, то можно будет получать молоко, не содержащее лактозы. Такое молоко незаменимо для многих людей, не переносящих лактозу; после приема молока или молочных продуктов у них возникает серьезное желудочное расстройство. Трансгеноз крупного рогатого скота — это весьма перспективный подход, но создание большого числа трансгенных животных потребует времени, ведь для того чтобы вырастить половозрелое животное из оплодотворенной яйцеклетки, нужно примерно 2 года.

Весьма актуально создание домашних животных с наследственной устойчивостью к бактериальным и вирусным инфекциям и паразитарным инвазиям. Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью к бактериальным инфекционным заболеваниям — маститу (коровы), дизентерии (новорожденные поросята), холере (домашняя птица). Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать несущих его трансгенных животных. В настоящее время для борьбы с инфекционными заболеваниями домашних животных используют прививки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тщательное наблюдение. Стоимость всех этих мероприятий может достигать 20% обшей стоимости конечной продукции.

Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании путем трансгеноза наследуемых иммунологических механизмов. С этой точки зрения рассматривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадеживающими на настоящее время являются предварительные результаты, полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L-цепи какого-либо моно-клонального антитела. Идея этого подхода заключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с помощью прививок.

Введение в организм реципиента генов антител, которые связываются со специфическими антигенами, было названо иммунизацией in vivo. Для этого гены Н- и L-цепей иммуноглобулинов моноклонального мыши-

Трансгенныеживотные 435

ного антитела к антителу, связывающемуся с 4-гидрокси-3-нитрофенилацетатом, вводили с помощью микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки мыши, кролика и свиньи. Во всех случаях в сыворотке трансгенных животных обнаруживалась соответствующая активность моноклонального антитела. Однако количество моноклональных антител, содержащих цепи H и L, было невелико. Чтобы установить, можно ли решить эту проблему, необходимо протестировать различные трансгенные конструкции.

Трансгенные овцы, козы и свиньи

Опыты по трансгенозу в случае овец и коз в основном были направлены на превращение молочных желез этих животных в своеобразные биореакторы для получения белковых продуктов, использующихся в медицине. Несмотря на то что надои у овец и коз меньше, чем у коров, за год они дают сотни литров молока. С помощью метода, аналогичного используемому для создания трансгенных мышеи и трансгенных конструкций, содержащих гены человека под контролем промоторов, специфичных для молочных желез (табл. 19.2), были созданы трансгенные овца и коза, в молоко которых секретировались белки человека. Они были гликозилированы и обладали активностью, близкой к таковой соответствующих белков, получаемых от человека. Однако, для того чтобы убедиться в полной эквивалентности этих белков, нужны дополнительные исследования. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потомство. В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычьего гормона роста под контролем промотора металлотионеина неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа быстрее прибавляла в весе. К сожалению, этот положительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмечались язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Причины этих симптомов неизвестны. Возможно, они связаны с долговременным присутствием в организме избытка гормона роста. В этих экспериментах трансген синтезировался более или менее непрерывно. Были созданы также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для этого кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста 1 была помещена под контроль мышиного промотора гена кератина с высоким содержанием серы, что обеспечивало гиперэкспрессию кДНК, При этом у трансгенных овец в отличие от свиней никаких нежелательных побочных эффектов не наблюдалось.

Положительные результаты были получены и в ходе экспериментов с трансгенными свиньями. Например, были созданы здоровые трансгенные свиньи, в геноме которых присутствовала следующая генетическая конструкция: регуляторная область гена ß-глобина человека, два гена ₁-глобина человека и один ген ß^А-глобина человека. В результате ее экспрессии в клетках крови свиней синтезировался человече-

436 ГЛАВА 19

скин гемоглобин, при этом в результате замены человеческого промотора гена ß-глобина свиным человеческий гемоглобин синтезировался в значительно большем количестве. Человеческий гемоглобин, продуцируемый трансгенными свиньями, обладал такими же химическими свойствами, что и природный человеческий. Его можно было очистить от гемоглобина свиней обычной хроматографией.

Эти результаты указывают на принципиальную возможность замены цельной крови, используемой при трансфузии, человеческим гемоглобином, полученным методом трансгеноза. Однако изолированный гемоглобин переносит кислород не так эффективно, как гемоглобин в составе эритроцитов. Более того, он быстро разрушается в организме животного, которому был введен, а продукты его распада токсичны для почек. Таким образом, получение заменителя человеческой крови с помощью трансгеноза -это дело далекого будущего.

В последнее время большое внимание уделяется вопросу об использовании органов животных для трансплантации человеку. Основная проблема межвидовой трансплантации — это гиперострое отторжение. Гиперострое отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного органа. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель несущих антитела клеток и быстрая потеря пересаженного органа.

В естественных условиях воспалительная реакция блокируется особыми белками на поверхности клеток, выстилающих стенки кровеносных сосудов. Эти белки ингибиторы комплемента видоспецифичны. Было высказано предположение, что если бы ж