ГЛАВА 21. типу клеток. Так, вирус простого герпеса 1 типа (HSV) инфицирует нейроны и персистирует в них, часто вызывая у человека так называемые «простудные» высыпания

типу клеток. Так, вирус простого герпеса 1 типа (HSV) инфицирует нейроны и персистирует в них, часто вызывая у человека так называемые «простудные» высыпания, а иногда — энцефалит с летальным исходом. Вирус присутствует в нейронах в латентной форме, а при стрессе и гормональных нарушениях инициируется литический цикл.

Существует множество заболеваний, поражающих центральную и периферическую нервную систему: опухоли, метаболические и иммунные нарушения, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Неврологические заболевания, как правило, бывают хроническими и приводят к госпитализации больного чаще, чем все остальные болезни вместе взятые. Вследствие тропности HSV к нервным клеткам он является подходящим вектором для генной терапии таких заболеваний.

Геном HSV представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК длиной 152 т. п. н. Капсид вируса сливается с мембраной нейрона, и его ДНК транспортируется в ядро. Репродуктивный цикл вируса состоит из литической (репликация ДНК и образование вирусных частиц) и латентной (конденсация вирусного генома и активация как минимум двух так называемых латентно-ассоциированных промоторов) фаз.

Замена сегмента генома длиной примерно 30 т. п. н. ДНК-вставкой не оказывает заметного влияния на репликацию HSV, его упаковку или инвазионную способность. С другой стороны, большой размер генома HSV затрудняет генетические манипуляции с ним. Для решения этой проблемы в плазмиду Е. coli, которая может переносить до 8 т. п. н. чужеродной ДНК, встроили «усеченный» геном HSV, состоящий из точки инициации репликации и последовательности, ответственной за упаковку. Полученные HSV-производные назвали ампликонами (ампликон-плазмидами),

Большинство систем доставки генов на основе HSV предполагает использование вируса-помощника, который поставляет белки, необходимые для репликации и сборки вируса, но не образует инфекционные вирусные частицы, поскольку его геном модифицирован и не способен упаковываться. Для получения рекомби-нантного HSV осуществляют трансфекцию ампликон-плазмиды в инфицированную вирусом-помощником клетку-хозяина. ДНК ампликона реплицируется по типу «катящегося кольца»: внутренняя кольцевая цепь играет роль матрицы, а во внешней происходит разрыв, и к свободной 3’-концевой ОН-группе ковалентно присоединяются нуклеотиды. Растущая цепь представляет собой линейную тандемную последовательность сегментов, комплементарных внутренней цепи, и, отсоединяясь от нее, сама становится матрицей для синтеза комплементарной цепи, В результате образуется линейная двухцепочечная молекула — множественная копия ампликона. Длина каждого ампликона составляет 15 т. п. н,, поэтому набор из 10 тандемных копий соответствует полноразмерному геному HSV и упаковывается в HSV-капсид (рис. 21.9).

Рекомбинантный HSV можно получить и с помощью котрансфекции клеток-хозяев, в которых вирус может реплицироваться, с помощью ДНК HSV дикого типа и плазмиды, которая содержит «терапевтический» ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных участков HSV-генома, ДНК HSV дикого типа реплицируется в ядре клетки-хозяина, при этом в результате рекомбинации «терапевтический» ген может встроиться в HSV-геном. Затем частицы как рекомбинантного, так и дикого типа HSV упаковываются и высвобождаются из клеток. Доля рекомбинантных HSV в общем вирусном пуле очень мала, поэтому вирусы размножают, а затем с помощью ПЦР или гибридизации выявляют «терапевтический» ген в образовавшихся бляшках. Рекомбинантный вирус хранят в условиях, не допускающих его загрязнения HSV дикого типа (рис. 21.10).

Доклинические испытания на экспериментальных животных показали, что гены, доставленные с помощью HSV-векторов в клетки мозга и периферической нервной системы, экспрессируются и поддерживаются длительное время. Однако до начала I фазы клинических испытаний HSV-векторов необходимо провести дополнительные исследования.

Невирусные системы доставки генов

В опосредованной вирусами доставке генов участвуют клеточные рецепторы, с помощью которых вектор проникает в клетку-мишень, не разрушаясь лизосомными ферментами, и векторная

Генная терапия 499

Рнс. 21.9. Вектор на основе HSV-ампликон-плазмиды. Точка инициации репликации HSV(ori HSV). сигнал упаковки HSV и «терапевтический" ген (ТГ) встраивают в плазмиду Е. coli (HSV-ампликонплазмида). Проводят трансфекцию клетки-хозяина, инфицированной вирусом-помощником HSV, полученной плазмидой. ДНК ампликон-плазмиды реплицируется по типу «катящегося кольца». 10 ампликонов, соответствующих полноразмерному геному HSV, упаковываются в HSV-капсид, который поставляет вирус-помощник HSV. Геном этого вируса не упаковывается. HSV-частицы, несущие множество копий «терапевтического» гена, высвобождаются при лизисе клетки и используются для трансдукции нейронов.

ДНК попадает в ядро. Однако вирусные векторы имеют ряд недостатков: они дорогостоящи и часто обладают ограниченной клонирующей емкостью, что не позволяет регулировать экспрессию «терапевтического» гена с помощью тканеспецифичных последовательностей. Кроме того, вирусные белки могут вызывать воспалительную реакцию, что исключает повторное введение вектора. Поэтому были разработаны невирусные системы доставки генов.

Самая простая из них — прямое введение ДНК-конструкций в клетки ткани-мишени. Если в скелетную мышцу мыши инъецировать плазмидную ДНК, то она проникнет в некоторое число клеток, о чем свидетельствует экспрессия гена-ре портера в течение по крайней мере 50 сут. Однако применение этого подхода ограничивается тем, что не все ткани доступны для инъекций, а кроме того, нужны большие количества ДНК. Можно бомбардировать с помо-

500 ГЛАВА 21

Рис. 21.10. Образование HSV-вектора с помощью рекомбинации. Проводят котрансфекцию клетки-хозяина плазмидой, которая содержит «терапевтический» ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных областей HSV-генома, и ДНК НSVдикого типа. HSV-геном реплицируется в клеточном ядре по типу «катящегося кольца», при этом между фрагментами ДНК HSV, входящими в состав плазмиды, и ДНК HSV дикого типа может произойти рекомбинация (штриховая линия). Молекулы ДНК HSV дикого типа и рекомбинантного HSV упаковываются в вирусные частицы, высвобождающиеся из клетки после лизиса. Вирусы размножают и проводят скрининг бляшек для идентификации рекомбинантных HSV. Полученные HSV-векторы хранят в условиях, исключающих их загрязнение HSV дикого типа.

Генная терапия 501

щью генного «ружья» клетки кожи или — через надрез — клетки подкожной опухоли конъюгированными с ДНК частицами золота диаметром 1—3 мкм. Введенные таким образом «терапевтические» гены экспрессируются в тканях-мишенях, а их продукты поступают в кровь. Это может облегчить доставку терапевтического белка в ткань-мишень, прямой доступ к которой затруднен. Однако большинство белков, в норме не присутствующих в крови, инактивируются или разрушаются ее компнентами. Для решения этой проблемы нужны дополнительные исследования.

Проникновение ДН К через клеточную мембрану можно облегчить, окружив генетическую конструкцию искусственной липидной оболочкой, образующей липидную сферу (липосому) с водным содержимым. Созданы липосомы с самыми разными свойствами, например катион-ные липосомы, поверхность которых заряжена положительно; они связываются с отрицательно заряженной молекулой ДНК, образуя ДНК-липидный комплекс (липоплекс). Липоплексы легко образуются, относительно нетоксичны и неиммуногенны, но эффективность переноса генов с их помощью невысока, поскольку большая часть ДНК после попадания в клетку захватывается лизосомами и разрушается. Так, в одном из клинических испытаний по генной терапии муковисцидоза с использованием комплекса липосома— CFTR-генчастота трансфекции клеток назального эпителия оказалась довольно низкой, а экспрессия гена - непродолжительной.

Для доставки в клетки крупных генетических конструкций (>10 т. п. н.) с помощью эндосомного клеточного транспорта, позволяющего избежать лизосомного разрушения ДНК, образуют конъюгат ДНК с другими молекулами. Для этого поли-L-лизин ковалентно сшивают с молекулой, связывающейся со специфическим клеточным рецептором, а затем добавляют ДНК. В результате получается компактная, плотно скрученная структура (тор), на внешней поверхности которой располагаются сайты связывания с клеточным рецептором (рис. 21.11). К сожалению, подобный конъюгат, несмотря на свою специфичность, обладает низкой эффективностью трансфекции. Все созданные к настоящему времени невирусные системы доставки имеют два основных недостатка: I) низкая частота трансфекции, не позволяющая достичь нужного терапевтического эффекта; 2) непродолжительное время экспрессии «терапевтического» гена, не обеспечивающее эффективного лечения.

Возможно, подходящим терапевтическим вектором станет искусственная хромосома человека. Это связано с; 1) возможностью включения в нее протяженных сегментов чужеродной ДНК вместе с полным набором регуляторных элементов для одного или нескольких «терапевтических» генов; 2) возможностью использования геномного варианта «терапевтического» гена, обеспечивающего высокую эффективность его экспрессии; 3) стабильностью «терапевтического» гена и его длительной экспрессией как в пролиферирующей, так и в неделящейся клетке-мишени.

Искусственная хромосома содержит три основных элемента: концевые участки (теломеры), центромеру и точки инициации репликации. Свойства теломерных областей хромосом человека хорошо изучены, чего нельзя сказать о центромерах и точках инициации репликации, и существовали опасения, что искусственную хромосому человека не удастся сконструировать, пока не будут досконально изучены все ее элементы. Однако уже получены и поддерживаются в трансфицированной культуре клеток стабильные линейные искусственные хромосомы человека (микрохромосомы), состоящие из множества ДНК-повторов (длиной около 1 м. п. н.) центромерной области Y-хромосомы, высокомолекулярных фрагментов геномной ДНК и теломерных участков. В их центромерную область был встроен ген устойчивости к неомицину, что позволило использовать среду G4I8 в качестве селективной, В нескольких G418-устойчивых клетках были обнаружены микрохромосомы длиной от 6 до 10 м. п. н.

Две из трех микрохромосом были получены «усечением» существующей хромосомы. В одном случае исходная центромера была сохранена, а в другом заменена трансфицированной центромерной областью. Третью, полностью искусственную микрохромосому получили лигированием in vitro трех трансфицированных

502 ГЛАВА 21

ДНК-элементов. Ясно, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей «терапевтический(е)» ген(ы), вполне реально, но основной проблемой станет доставка этой огромной молекулы ДНК в ядро клетки-мишени. Кроме того, экспрессия генов, входящих в состав ДНК-блоков, из которых построена искусственная хромосома, может оказывать вредные воздействия на клетки-мишени. Для начала в ткани пациента можно попытаться имплантировать инкапсулированные клетки с искусственными хромосомами.

Рис. 21.11. Система доставки «терапевтических» генов с использованием ДНК-конъюгата, А. К поли-L-лизину пришивают лиганд, соединяющийся с поверхностным клеточным рецептором, и добавляют ДНК, содержащую «терапевтический» ген. В результате образуется конденсированная структура, на поверхности которой располагаются лиганды. Б. ДНК-конъюгат связывается со специфическим клеточным рецептором (1) и обволакивается клеточной мембраной (2) с образованием эндосо-мы (3), которая защищает его от лизосом. В эндосоме часть молекул ДНК высвобождается из конъюгата и проникает в ядро клетки (4), где и происходит экспрессия «терапевтического» гена.

Генная терапия 503

Активация предшественника лекарственного вещества («пролекарства»)

Несмотря на широкое применение хирургических методов лечения, лучевой и химиотерапии, злокачественные новообразования по-прежнему остаются одной из основных причин смерти людей, поэтому задача разработки новых способов их лечения является весьма актуальной. Одним из таких способов является уничтожение пролиферирующих опухолевых клеток с помощью ганцикловира [GCV; 9-(1,3-Дигидрокси-2-пропоксиметил)гуанина], активированного продукта гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk). Для этого проводят in vivo трансдукцию или трансфекцию опухолевых клеток геном HSVtk, находящимся под контролем активного промотора, а через несколько дней вводят ганцикловир. Вирусная тимидинкиназа фосфорилирует ганцикловир с образованием ганцикловирмонофосфата. Киназы клетки-хозяина почти не фосфорилируют ганцикловир, зато охотно присоединяют фосфатные группы к его монофосфату с образованием ганцикловир-трифосфата, который ингибирует ДНК-полимеразу и останавливает синтез ДНК, вызывая гибель пролиферирующих клеток. Кроме того, через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат может проникать в нетрансфицированные опухолевые клетки, приводя и к их гибели. Одна экспрессирующая ген HSVtk опухолевая клетка может уничтожить до 10 немодифицированных клеток. Это явление называется «эффектом свидетеля».

Ген, вызывающий при определенных условиях гибель собственной клетки, называют геном «самоубийства», а термин «пролекарство» относится к неактивной форме лекарственного вещества, которая аюлвируется с помощью другого компонента терапевтической системы. Разработаны и другие комбинации «пролекарство» — ген-активатор, но система GCV—HSVtk используется чаще других.

Эффективность системы GCV-HSVtk доказана целым радом доклинических испытаний. Однако I фаза ее клинических испытаний, в которых участвовали больные с терминальной стадией рака, не показала регресса опухоли. Возможно, ген HSVM был трансдуцирован в слишком малое число опухолевых клеток и, несмотря на «эффект свидетеля», не мог подавить рост опухоли. В настоящее время разрабатываются новые подходы, которые смогут повысить частоту трансдукции и доставить ген HSVtk в клетки по всему объему опухоли.

Для генной терапии рака разработаны также комбинированные подходы, использующие две разные системы генов. В одном из них сочетаются GCV—НSVtk-терапия и генная иммунотерапия (рис. 21.12). Одну часть опухолевых клеток трансдуцируют геном HSVtk, другую -клонированной кДНК (или геном) одного из цитокинов. Цитокины (интерлейкин-2, интерлейкин-12 и другие) играют роль сигнала, мобилизующего клетки иммунной системы и стимулирующего иммунный ответ. Показано, что опухолевые белки, которые высвобождаются из клетки, уничтоженной в результате терапии с помощью гена «самоубийства», взаимодействуют с иммунными клетками, привлекаемыми к месту локализации опухоли цитокином, и запускают противоопухолевую иммунную реакцию. Кроме того, противоопухолевые антитела, поступая в кровоток и циркулируя по всему организму, предотвращают появление метастазов.

Этот подход к генной терапии рака был проверен экспериментально: в печень животных имплантировали клетки рака толстой кишки, раздельно трансдуцированные генами HSVtk одного из цитокинов. Введение ганцикловира останавливало рост опухоли в печени. Опухоль не возникала и при введении нетрансдуцированных опухолевых клеток в другие ткани такого животного. У контрольных животных в аналогичных условиях происходило развитие опухолей во всех местах введения нетрансдуци-рованных клеток рака толстой кишки. Несмотря на столь многообещающие результаты, прежде чем приступать к клиническим испытаниям терапии с использованием гена «самоубийства» или различных комбинаций генной терапии, необходимо установить, какие опухоли будут поддаваться такому лечению и не вызовет ли оно побочных эффектов.

Лекарственные средства на основе олигонуклеотидов

В большинстве протоколов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, который не синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания