Клонированных в прокариитических

системах.......................................................................... 105

Экспрессия генов при участии сильных
регулируемых промоторов........................ 105

Оглавление 5S5

Регулируемые промоторы.......................... 107

Получение больших количеств белковых

продуктов................................................. 108

Крупномасштабные системы..................... 109

Использование для экспрессии других

микроорганизмов...................................... 111

Химерные белки........................................... 112

Расщепление химерных белков................. 112

Применение химерных белков.................. 113

Включение белков в поверхностные струк-
туры ......................................................... 115

Однонаправленное тандемное

расположение генов...................................... 117

Трансляционные экспрессирующие век-
торы............................................................. 118

Стабилизация белков.................................... 121

Рост в условиях недостатка кислорода.......... 122

Применение хозяйских штаммов с дефи-
цитом протеиназ......... ,............................ 122

Бактериальный «гемоглобин»................... 122

Инте1риция чужеродной ДНК в хромосо-
му хозяина................................................... 123

Повышение эффективности секреции........... 126

Метаболическая перегрузка........................... 127

Заключение................................................... 130

Литература.................................................... 131

Контрольные вопросы................................... 133

Глава 7. Получение рекомбиыантных белков

с помощью эукариотических систем.................. 135

Системы экспрессии Saccharomyces сеге-

visiae................................................................................. 136

Векторыдля S. cerevisiae......................... ,...137

Прямая экспрессия в S. cerevisiae............... 137

Секреция гетерологичных белков, синте-
зируемых S. cerevisiae................................ 139

Другие дрожжевые системы экспрессии........ 140

Синтез поверхностного антигена вируса

гепатита В................................................. 141

Синтез бычьего лизоцима С2..................... 142

Системы экспрессии с использованием

культур клеток насекомых............................. 143

Система экспрессируюших векторов на

основе бакуловирусов............................... 144

Получение рекомбинантных бакулови-
русов........................................................ 145

Создание челночного вектора на основе
бакуловирусов для E. coli и клеток на-
секомых ....................................................... 146

Выделение рекомбинантного белка из кле-
ток насекомых с помощью аффинного
связывания.. ...149

Экспрессирующие векторы для работы с

клетками млекопитающих............................ 149

Селективные маркерные гены................... 150

Экспрессия двух клонированных генов

в одной клетке млекопитающих................ 151

Заключение.................................................. 154

Литература................................................... 155

Контрольные вопросы.................................. 156

Глава 8. Направленный мутагенез и генная
инженерия белков........................................ 158

Направленный мутагенез: методика.............. 158

Олигонуклеотид-направленныЙ мутагенез

с использованием ДНК фага М13.............. 159

Олигонуклеотид-направленныЙ мутагенез

с использованием плазмидной ДНК.......... 161

Олигонуклеотид-направленныЙ мутагенез

с использованием ПЦР-амплификации...... 163

Случайный мутагенез с использованием
«вырожденных» олигонуклеотидных i iptm-

меров........................................................ 163

Случайный мутагенез с использованием

аналогов нуклеотидов............................... 166

Генная инженерия белков............................. 168

Образование дополнительных дисульфид-

ных связей.................................. ,............ 168

Замена аспарагина на другие аминокис-
лоты......................................................... 170

Уменьшение числа свободных сульфгид-

рильных групп.......................................... 170

Повышение ферментативной активности.. 171

Измене!гие ιюгребности ферментов в ме-
таллических кофакторах............................ 172

Изменение специфичности фермента........ 173

Повышение стабильности и специфич-
ности фермента......................................... 174

Заключение.................................................. 175

Литература................................................... 175

Контрольные вопросы.................................. 176