Электрохимические методы выделения целевого продукта, ионообменная хроматография, иммуноэлектрофорез.

Более современные методы разделения в-в включают хроматографию, электрофорез, изотахофорез, электрофокусировку, которые основаны на принципах экстракции и адсорбции.

Разделение веществ путем хроматографии основано на их неодинаковом распределении между двумя несмешивающимися фазами. Различают хроматографию на бумаге, пластинках и колонках. При хроматографии на бумаге или на пластинках одной из несмешивающихся фаз является движущийся растворитель, а другой (неподвижной фазой) служат волокна бумаги или частицы покрывающего пластинку какого-то материала (например, силикагеля). При колоночной хроматографии подвижной фазой является протекающий через колонку растворитель, а неподвижную фазу представляет заполняющий колонку адсорбент (чаще всего это гранулированный гель). Колоночная хроматография допускает масштабирование процесса, в результате чего она довольно широко применяется в промышленных условиях и включает несколько разновидностей:

· Ионообменная хроматография, колонка наполняется гранулами адсорбента, которые несут заряженные катионные (NH₄) или анионные (SO₄) группы, способные захватывать ионы противоположного заряда. Данный метод используется для выделения ионизированных веществ из жидкости, а также для очистки нейтральных соединений от примесей ионной природы.

· Метод "молекулярных сит", гель-хроматография, гель-фильтрация. Виды хроматографии, основанные на разделении веществ с различной молекулярной массой и диаметром частиц. Адсорбент захватывает и удерживает, например, только низкомолекулярные соединения, пропуская соединения с более высокой молекулярной массой.

· Афинная хроматография. Метод базируется на задерживании комплекса, образующегося из компонента разделяемой смеси и лиганда, который фиксирован на частицах носителя (наполнителя колонки). При данном методе используются агенты, способные специфически связывать какое-нибудь одно конкретное вещество. Например, фермент очищают на колонке, заполненной его субстратом или специфическим ингибитором (таблица).

Весьма эффективный метод разделения и очистки белковых и небелковых веществ основан на взаимодействии антигенов и антител. Разработанный на основании таких взаимодействий способ получил название имунно-аффинной хроматографии, который существенно повысил разрешающую способность при введении в практику использования моноклональных антител. Блестящей иллюстрацией его эффективности является высокая степень одноэтапной очистки человеческого интерферона (чистота повышается примерно в 500 раз).

В аффинной хроматографии могут использоваться групповые лиганды, связывающие, например, группу сходных по структуре ферментов. Такими лигандами являются кофакторы ферментов или их аналоги. Могут применяться и еще менее специфичные лиганды, связывающие довольно обширные классы веществ; например, алкильные и арильные группы или лиганды, представляющие собой текстильные красители.

Преимущество аффинной хроматографии состоит в том, что с ее помощью можно в одну стадию осуществить полную очистку продукта из сложной многокомпонентной смеси (культуральной жидкости, цельных клеточных экстрактов и т. п.), тогда как другие способы требуют многоэтапной очистки и сопряжены с большими затратами труда и времени. Однако метод имеет и ряд недостатков, в частности высокая цена материалов, используемых в аффинной хроматографии (например, веществ, применяемых в качестве лигандов), а также быстрое забивание колонки пропускаемыми веществами. Последнее заставляет использовать их в периодическом, а не в непрерывном режиме. После каждого выделения продукта колонки промывают и частицы заполняющего геля также подвергаются очистке.

Помимо аффинной хроматографии (которая иногда называется еще аффинной адсорбцией в геле) в крупномасштабных биотехнологических процессах для очистки продуктов все шире применяют аффинную преципитацию и аффинное разделение.

При аффинной преципитации лиганд соединяется с растворимым носителем и, после взаимодействия с соответствующим выделяемым соединением, образующийся комплекс по мере его формирования выпадает в осадок. Иногда ускорение выпадения преципитата достигается путем добавления электролитов.

Аффинное разделение основано на использовании системы, состоящей из двух водорастворимых полимеров, один из которых несет специфические лиганды, а другой обладает сродством к примесным компонентам. В качестве примера можно привести разделение нуклеиновых кислот и белков. Для полимера, соединяемого с лигандом, берется полиэтиленгликоль, а другим компонентом является декстран.

Наряду с хроматографией перспективными методами разделения веществ при биотехнологических процессах являются электрофорез и его модификации. В этих методах разделяемая смесь помещается в мощное электрическое поле, обеспечивающее движение ионизированных компонентов смеси. Различие в электрофоретической подвижности позволяет пространственно разделить входящие в ее состав компоненты. Современные варианты электрофореза используют (как и хроматография) пластинки или колонки с образующими гель наполнителями (агароза, полиакриламид, сефароза, оксиапатит и др.).

Модификацией метода электрофореза является изоэлектрическая фокусировка или электрофокусировка. В этом методе раствор, насыщающий гель, содержит соединение с кислотно-основными группами. Под влиянием электрического поля кислотно-основные группы буферного соединения меняют степень ионизации, создавая тем самым градиент рН в направлении электрического поля. Электрически заряженные компоненты разделяемой смеси, нанесенной на гель, мигрируют по направлению к электроду противоположного знака. Поскольку эти компоненты передвигаются по градиенту рН, то они постепенно теряют свои заряды и в зоне, где рН соответствует изоэлектрической точке (точке электронейтральности), их движение прекращается. Каждый компонент концентрируется (фокусируется) в определенной области геля.