Роль отечественной микробиологии в санитарном и противоэпидемическом обеспечении Российской Армии и укреплении обороноспособности нашей страны.

МОРФОЛОГИЯ МИКРОБОВ

Определение понятия о микробах. Понятие о виде микробов. Основные принципы классификации микроорганизмов. Критерии и признаки, используемые при классификации. Нумерическая таксономия.

Микроорганизмы — это невидимые простым глазом представители всех царств жизни: эукариоты, прокариоты (эубактерии и архебактерии), виру­сы и плазмиды. Они занимают низшие ступени эволюции, но играют важ­ную и разнообразную роль в общей экономике природы, в круговороте ве­ществ, в патологии человека, животных и растений.

Вид — группа или совокупность близких между собой организмов, которые имеют общий ко­рень происхождения, на данном этапе эволюции характеризуются определен­ными морфологическими, биохимическими и физиологическими признаками, обособлены отбором от других видов и приспособлены к определенной среде обитания.

Специфические особенности микроорганизмов определили и набор тех призна­ков и свойств, которые используются для их систематики и классификации.

-Морфологические признаки — величина, форма, характер взаиморасполо­жения.

-Тинкториальные свойства — способность окрашиваться различными кра­сителями. Особенно важным признаком является отношение к окраске по Граму, ко­торое зависит от структуры и химического состава клеточной стенки бактерий. По этому признаку все бактерии делятся на грамположительные и грамотрицательные Морфологические свойства и отношение к окраске по Граму определяют принад­лежность к крупным таксонам — роду, семейству и т. д.

-Культуральные свойства — особенности роста бактерий на жидких (образова­ние пленки, осадок, помутнение) и плотных (форма, размеры, консистенция, края, по­верхность, прозрачность колоний, образование пигмента и другие свойства) питатель­ных средах. В микробиологии широко используют такие специфические термины, как «колония», «культура», «штамм», «типы» или «варианты». Под колонией принято по­нимать видимую простым глазом изолированную структуру, образующуюся в резуль­тате размножения и накопления бактерий за определенный срок инкубации. Колония образуется обычно из одной родительской клетки или из нескольких идентичных кле­ток. Поэтому пересевом из изолированной колонии может быть получена чистая куль­тура возбудителя. Под культурой понимают всю совокупность бактерий, выросших на плотной или жидкой питательной среде. Как колония, так и культура каждого вида ха­рактеризуются определенными признаками. Основной и главный принцип бактерио­логии — во избежание ошибок изучать свойства только чистых, однородных культур. Каждая выделенная культура данного вида бактерий называется также штаммом, т. е. конкретным образцом данного вида. Штаммы одного и того же вида бактерий, различающиеся по антигенному строению, называют серотипа- ми (сероварами, серовариантами), по чувствительности к фагу — фаготипами (фагова- рами), по биохимическим или культуральным признакам — биотипами (биоварами) и т. п. Штамм можно считать низшей таксономической единицей бактерий.

-Подвижность бактерий. Различают бактерии подвижные и неподвижные. Подвижные бактерии подразделяют на ползающие, или скользящие, они передвига­ются за счет волнообразного сокращения клеток; и плавающие бактерии, у которых активная подвижность связана с наличием жгутиков.

-Спорообразование — форма и характер расположения споры в клетке.

-Физиологические свойства — способы углеродного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) питания; тип дыхания: аэро­бы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы, микроаэрофилы.

-Биохимические свойства — способность ферментировать различные угле­воды, протеолитическая активность, образование индола, сероводорода, наличие уреазы и других ферментов и т. д.

-Чувствительность к специфическим бактериофагам.

-Антигенные свойства. Они зависят от химического состава клеточной стен­ки и жгутиков бактерий.

-Химический состав клеточных стенок (содержание и состав основных Сахаров и аминокислот).

-Липидный и жирнокислотный состав. Изучение состава жирных кислот проводят с помощью газовой хроматографии, которая обладает высокой раздели­тельной способностью и чувствительностью.

-Белковые спектры. С помощью различных методов фракционирования, а главным образом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле, разделяют сложные смеси рибосомных, мембранных или внутриклеточных белков и получают электрофореграммы, или белковые спектры, соответствующей фракции данного ви­да бактерий.

В связи с тем, что количество фенотипических признаков, используемых для клас­сификации микроорганизмов, значительно возросло, в конце 50-х гг. XX в. возникла нумерическая (численная) таксономия.

Ее возникновению способствовало появление более совершенных компьютерных систем, которые позволяют быстро и точно произ­водить громоздкие математические расчеты. В основе нумерической таксономии ле­жит принцип сопоставления организмов по возможно большему количеству учитыва­емых признаков при допущении, что все они для систематики равноценны. Однако принцип равнозначности является основным недостатком этого метода.

2. Специальные методы микроскопии: люминесцентная, фазовоконтрастная, темнопольная. Понятие об электронной микроскопии. Принципы устройства и работы электронного микроскопа.

Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия.Осно­вана на явлении фотолюминесценции.

Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воз­действия на них каких-либо источников энергии: световых, элек­тронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесцен­ция — люминесценция объекта под влиянием света. Если осве­щать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В ре­зультате возникает цветное изображение объекта.

Темнопольная микроскопия.Микроскопия в темном поле зре­ния основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в био­логическом микроскопе .

Фазовоконтрастная микроскопия.Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объек­та на темном фоне.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители.

Электронная микроскопия.Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способно­сти светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмик­роскопических объектов.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптические элементы заменены соответствующими элек­трическими: источник света — источником электронов, стеклянные линзы — линзами электромагнитными. В электронных микроскопах просвечивающего типа различа­ют три системы: электронно-оптическую, вакуумную, электропитания. Фотографи­рование изображений при всех видах исследований проводится на фотопластинки или фотопленку. Источником электронов является электронная пушка, состоящая из v образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900 °С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испуска­ет свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создавае­мым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем форми­руется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Элек­троны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроноплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое полезное увеличение объекта.

После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, кото­рая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Проекционная линза создает конеч­ное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцирую­щий экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экра­на на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточ­ной и проекционной линзами.

Строение бактериальной клетки. Функции клеточной стенки. Структура клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Пептидогликан, липополисахарид, липопротеин, внешняя мембрана, их структура, функции.

Бактериальная клетка состоит из клеточной стенки, цитоплазматической мембраны, цитоплазмы с включениями и яд­ра, называемого нуклеоидом. Имеются дополни­тельные структуры: капсула, микрокапсула, слизь, жгутики, пили. Некоторые бактерии в неблагоприятных условиях спо­собны образовывать споры.

Функции клеточной стенки:

1. Определяет и сохраняет постоянную форму клетки.

2. Защищает клетку от механических и осмотичес­ких сил внешней среды.

3. Участвует в регуляции роста и деления клеток.

4. Обеспечивает коммуникацию с внешней средой через каналы и поры.

5. Несет на себе специфические рецепторы для бактериофагов.

6. Определяет во многом антигенную характеристику бактерий (природу и спе­цифичность О- и К-антигенов).

7. Содержащийся в ее составе пептидогликан наделяет клетку важными иммуно­биологическими свойствами.

8. Нарушение синтеза клеточной стенки бактерий является главной причиной их L-трансформации.

Метод выявления клеточной стенки - электронная микроскопия, плазмолиз.

Особенности клеточной стенки грамотрицательных бактерий

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий значительно тоньше, и у боль­шинства из них ее толщина составляет 14—18 нм. Четко выделяются два слоя - наружный — пла­стичный и внутренний — ригидный. Основная особенность клеточной стенки грамотрицательных бактерий: ригидный слой тонкий, представлен одним слоем пептидогликана, на долю которого приходится до 5—10 % су­хого веса стенки. Для пептидогликана характерно низкое содержание поперечных сшивок между пептидными цепочками, однако в нем почти всегда имеется диаминопимелиновая кислота.

В составе клеточной стенки содержится много липопротеинов, фосфолипидов, липополисахарид, больше белка и, как правило, отсутствуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки у грамотрицательных бактерий представляет собой сложную мозаику, образованную из липопротеинов, липополисахаридов и на­ружной мембраны.

-Пептидогликан вклю­чает в себя остов и два набора пептидных цепочек — боковых и поперечных. Остов пептидогликана одинаков у всех бактерий и состоит из чередующихся молекул аминосахаров — N-ацетилглюкозамина (N-АцГлю) и

N-ацетилмураминовой кисло­ты (N-АцМур), связанных между собой b-гликозидными связями. Боковые цепочки в каждой молекуле пептидогликана представлены набором идентичных тетрапептидов. Поперечные цепочки также представлены набором из идентичных для данной молекулы пептидогликана пентапептидов, содержащих глицин, — пентаглицинов, однако у разных видов бактерий боковые и поперечные пептиды раз­личны. В тетрапептидной боковой цепочке у большинства грамотрицательных бактерий имеется диаминопимелиновая (диаминопимеловая) кислота (ДАП) — уникальный компонент клеточной стенки, обнаруженный только у прокариот. Кро­ме того, в составе боковых цепочек пептидогликана обнаружены О-аминокислоты (Б-аланин, Б-глутамин). Боковые тетрапептиды связаны с М-ацетилмураминовой кислотой остова. Связывание боковых тетрапептидов между собой происходит пу­тем образования поперечных пентаглициновых мостиков между D-аланином одной цепи и диаминопимелиновой кислотой (или иной аминокислотой) другого боково­го пептида. Наличие двух типов связей (гликозидные и пептидные), которые соеди­няют субъединицы пептидогликанов, придает этому гетерополимеру структуру мо­лекулярной сети. Благодаря этим связям пептидогликановый слой клеточной стенки образует огромного размера ригидную мешковидную макро­молекулу, которая окружает протопласт, уравновешивает его тургорное давление (у Е. соli — до 15 атм.) и придает ему определенную постоянную форму. Пептидогли­кан может разрушаться под действием различных ферментов, а его синтез блокиру­ют бета-лактамные антибиотики.

-Липопротеины связывают наружную мембрану с пептидогликаном (белок свя­зан с диаминопимелиновой кислотой бокового тетрапептида, а липид — нековалент- но с наружной мембраной).

-Липополисахарид (ЛПС) состоит из комплекса липида А и связанного с ним по­лисахарида, состоящего из ядра, которое одинаково у всех грамотрицательных бак­терий, и терминальной цепочки из повторяющихся Сахаров (рис. 6). Последние у разных видов бактерий различаются по химической природе. Они обычно пред­ставлены линейными трисахаридами или разветвляющимися тетра- или пентасаха- ридами. Терминальные повторяющиеся единицы полисахарида ЛПС располагаются на поверхности клетки в виде микроворсинок и определяют ее антигенную специ­фичность. ЛПС синтезируется на цитоплазматической мембране, а затем транспор­тируется в наружную часть клетки, он прикреплен к наружной мембране с помощью гидрофобных связей. ЛПС выполняет две важнейшие функции у грамотрицатель­ных бактерий: во-первых, он определяет их антигенную специфичность, а во-вто­рых, является одним из главных факторов их патогенности. ЛПС — это эндотоксин. Его токсичность определяется липидом Кроме того, ЛПС в организме запускает синтез около 20 различных биологически активных соединений, которые опосреду­ют патогенез эндотоксикоза, и обладает пирогенным действием.

-Наружная мембрана, подобно любой биологической мембране, состоит из двух слоев липидов, но в ней значительная часть фосфолипидов наружного слоя замеще­на молекулами липополисахаридов и набором белков, локализованных мозаично (рис. 7). В состав этих белков, заключенных в фосфолипидную матрицу, входят 3 или 4 основных (тарт), которые составляют около 70 % суммарных белков на­ружной мембраны; липопротеины и второстепенные белки, числом более 10. Два из основных белков проходят через оба слоя мембраны и прочно связаны с пептидо­гликаном. Эти белки-порины располагаются в виде триплетов и образуют диффузи­онные поры, через которые в клетку проникают мелкие гидрофильные молекулы. Второстепенные белки выполняют разнообразные специфические функции: одни из них участвуют в облегченной диффузии, другие - в активном транспорте молекул через наружную мембрану и выступают в качестве специфических рецепторов для фагов и колицинов. Некоторые из этих белков участвуют в конъюгации (являются рецепторами для донорных ворсинок), в контроле репликации ДНК и регуляции клеточного деления. Наружная мембрана осуществляет также функцию барьера,

через который в клетку не способны проникать крупные молекулы (один из механизмов неспецифической ус­тойчивости грамотрицательных бак­терий к антибиотикам). Если бакте­рии поместить в гипертонический раствор, наступает резкое обезвожи­вание клеток, цитоплазма съежива­ется, и протопласт отходит от кле­точной стенки. Это явление называ­ется плазмолизом. В результате плазмолиза клетки гибнут. Этим свойством широко пользуются для консервирования пищевых продук­тов с помощью концентрированных растворов поваренной соли или сахара.