Морфология и химический состав вирусов. Отличие вирусов от других организмов. Методы культивирования вирусов. Культуры клеток и их характеристика.

Первооткрывателем вирусов, основоположником вирусологии яв­ляется русский ученый Дмитрий Иосифович Ивановский, открывший в 1892 году вирус табачной мозаики (ВТМ)

Вирусы настолько отличаются от микроорганизмов, что выделе­ны в особое царство - царство Vira.

Особенности вирусов, отличающие их от всех других живых су­ществ:

1) наличие только одного типа нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК, в то время как клетки всех остальных живых существ содержат ДНК и РНК, взаимодействие которых необходимо для биосинтеза бел­ков;

2) отсутствие собственных белоксинтезирующих систем и клеточ­ного строения;

3) внутриклеточный паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне;

4) убиквитарность (распространенны повсеместно);

5) имеют микроскопические размеры.

Внеклеточная форма вируса - вирион и вирус, находящийся внут­ри клетки хозяина - это две разные формы вируса.

Вирионы разных вирусов имеют размеры от 15 до 400 наномет­ров. Нанометр - это 10^-9 метра (рис. 6). Наиболее мелкие вирусы - виру­сы полиомиелита - имеют вирион размером 17-25 им, средние - вирус гриппа - 80-120 нм, крупные - вирус оспы - 300-400 им.

В центре вириона располагается его геном. Это нуклеиновая кис­лота - ДНК или РНК (однонитевая или двунитевая). Плюс-однонитевая РНК несет две функции: наследственную и информационную, напри­мер у вируса полиомиелита. Минус-однонитевая РНК, как, например, у вируса гриппа, несет только наследственную функцию, и только в процессе репродукции вируса к ней достраивается плюс-нить иРНК.

Вокруг нуклеиновой кислоты симметрично располагаются белко­вые молекулы - капсомеры, составляющие капсид (лат. capsa - коробка). Различают спиральный тип симметрии, когда капсомеры уложены по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты, и кубический, когда кап­сомеры располагаются в виде двадцатигранника (икосаэдра).

Вирионы, содержащие только нуклеиновую кислоту и белок, сос­тавляют нуклеокапсид. Это простые вирусы, например, ВТМ, вирус полиомиелита.

У вирионов сложноорганизованных вирусов имеется еще поверхностная оболочка - суперкапсид, содержащий, кроме белков, также углево­ды, липиды, компоненты клет­ки хозяина. Строение вирио­на лежит в основе классифи­кации вирусов. По типу нук­леиновой кислоты их делят на: рибовирусы и дезоксири-бовирусы, далее по структу­ре вирионов, по месту размно­жения и по другим признакам проводится деление на семей­ства и роды.

Вследствие малых разме­ров вирусы не видны в свето­вом микроскопе. Только наи­более крупный из них - вирус оспы - можно наблюдать в виде мелких точечных образо­ваний - элементарных телец Пашена.

Размножаясь в чувствительных клетках организма, вирусы оспы, бе­шенства, гриппа образуют в них внутриклеточные включения. Их мож­но обнаружить в световом или в люминесцентном микроскопе. Обна­ружение внутриклеточных включений используется для диагностики. Например, включения Бабеша-Негри в нервных клетках об­наруживаются при бешенстве.

Морфологию вирионов изучают в электронном микроскопе. Ви­русы имеют разные формы: сферическую, нитевидную, палочковидную.

Методы культивирования вирусов:

1. Заражение животных (в\брюшинно, в\в, в\м, интраназально, заражение в мозг и другие)

2. На куриных эмбрионах после заражения их на хорион – аллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, в амниотическую полость, в желточный мешок.

3. На культуре клеток различных тканей.

Культура ткани – это клетки ткани, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определенным вирусам. Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются клетки с быстрым росток и высоким обменом веществ. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др.), а также культуры тканей опухолей. Выращивание клеток культур тканей производят в специальных флаконах (колбы – матрицы, флаконы Карреля и др.) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую – либо опору, например, пластинки стекла, стенку пробирки. В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда или пластинку стекла в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста другой микрофлоры (кроме вирусов) вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином. Размножение вируса в клетках определяют по цитопатическому действию (ЦПД): в результате размножения вируса в клетках при микроскопии обнаруживаются включения, дегенеративные изменения и в конечном итоге клетки гибнут. Так как рост клеток прекращается, ph среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса). В связи с этим не изменяется и цвет среды. Питательной средой для культуры тканей могут быть различные растворы, состав которых приближается к составу жидкостей организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие). В настоящее время в вирусологической практике чаще всего применят свежие культуры клеток (первичные или первично – трипсинизированные) и перевиваемые культуры (линии) клеток.

Первично – трипсинизированные культуры клеток готовят из органов взрослых животных (чаще из почек обезьян и других животных) и эмбрионов человека, куриных фиброфластов путем трипсинизации кусочков тканей с последующим культивированием в питательной среде. С этой целью кусочки тканей измельчают ножницами (или другим способом), а затем промывают буферным раствором Хенкса для удаления крови и обрабатывают 0,25 – 0,3 % раствором трипсина. Трипсин разрушает межклеточные мостики и освобождает клетки. С помощью камеры Горяева подсчитывают количество клеток, разводят до концентрации 400 тыс. клеток в 1 мл. Полученную взвесь клеток разливают в пробирки, плотно закрывают стерильными резиновыми пробками и помещают в термостат при 37°С в почти горизонтальном положении (под углом 50°) в специальных штативах. Через 3-4 дня на стенке пробирки образуется сплошной слой размножившихся клеток. Пробирки с хорошим ростом ткани отбирают для заражения вирусом.

Перевиваемые культуры клеток (растущие) - это стабильные линии клеток, пассируемые вне организма в течение многих лет. Их получают из злокачественных опухолей и из нормальных (эмбриональных) тканей человека и животных. К ним относятся: 1) линия Hela – клетки карциномы шейки матки человека; 2)линия Hep – 2 – клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) линия Детройт – 6 – клетки, выделенные из костного мозга человека, больного раком легких; 4) линии А – 0 и А – 1 – клетки амниона человека; 5) линия СОЦ – клетки сердца обезьяны циномольгус и другие.

Полуперевиваемые или диплоидные культуры клеток – это клетки тканей человека, сохраняющие в процессе пассажей – диплоидный набор хромосом. Диплоидные клетки человека не подвергаются злокачественному перерождению и этим выгодно отличаются от опухолевых.