Определение активности амилазы (сывороточная амилаза крови)

Принцип метода. Показателем активности фермента является убыль крахмала, расщепляемого под действием сывороточной амилазы.

Для построения стандартной кривой в 5 мерных колбочек емкостью 50 мл наливают по 30–40 мл воды, переносят по 0,5; 1.0; 2,0; 3,0; 4,0 мл раствора крахмала, добавляют по 0,5 мл раствора соляной кислоты, по 0,1 мл раствора йода, доводят водой до метки и перемешивают. Колориметрируют через 5 мин на ФЭКе с красным светофильтром относительно воды в кюветах с расстоянием 1 см между рабочими гранями.

Ход работы. В 2 центрифужные пробирки наливают по 0,5 смеси растворов крахмала и хлорида натрия и по 0,3 мл фосфатной буферной смеси. В пробирку 1 (опыт) добавляют 0,1 мл сыворотки крови, в пробирку 2 (контроль) – 0,1 мл дистиллированной воды. Обе пробирки инкубируются в термостате (37 °С) в течение 30 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 0,1 мл 1 н. раствора соляной кислоты и центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин. В мерные колбы (50 мл) наливают по 30–40 мл воды, переносят по 0,2 мл центрифугата и проводят цветную реакцию, как это описано для построения стандартной кривой.

Активность амилазы (Е) выражают количеством крахмала (мг), которое может расщепить за 30 мин фермент, содержащийся в 100 мл сыворотки. Расчет ведут по формуле:

, (11)

где Е – активность амилазы;

а – количество крахмала в опытной пробирке, найденное по стандартной кривой, мг;

b – количество крахмала в контрольной пробирке, найденное по стандартной кривой, мг;

100 – пересчет на 100 мл сыворотки;

0,1 –количество сыворотки, взятое для исследования, мл;

0,2 – количество центрифугата , взятое для цветной реакции, мл.

Материалы и реактивы. 1 %–ный раствор крахмала; 0,5 М раствор хлорида натрия; смесь 1 %–ного раствора крахмала с 0,5 М раствором хлорида натрия (4:1); фосфатный буфер, рН 7,2; сыворотка крови свежая без признаков гемолиза; 1 н. раствор соляной кислоты; 0,3 %–ный раствор йода в 3 %–ном растворе иодистого калия (см. Приложение 1, п. 2).

Оборудование. Штатив с центрифужными пробирками; пипетки; микропипетки (0,1 мл); термостат (37 °С); центрифуга; мерные колбы (50 мл); фотоэлектроколориметр.