Потенциал действия

Возбудимость – способность высокоорганизованных тканей (нервной, мышечной и железистой) реагировать на раздражение изменением физиологических свойств и генерацией процесса возбуждения. Возбуждение – это состояние, для которого характерна повышенная функциональная активность данных клеток и тканей. Важнейшим и обязательным признаком возбуждения является электрическая активность ткани в виде так называемого потенциала действия, который распространяется по ткани.

Открытие электрических явлений в тканях относят к 1791 г., когда итальянский ученый Луиджи Гальвани опубликовал результаты своих исследований. Занимаясь изучением физиологического действия разрядов электрической машины и атмосферного электричества, возникающего во время грозы, Гальвани подвешивал нервно-мышечный препарат лягушки на медный крючок к железной стойке балкона (чувствительность нервно-мышечного препарата к электрическому току превышала чувствительность всех имеющихся приборов и в течение долгого времени его использовали как индикатор слабых электрических токов). Каждый раз, когда мышца препарата касалась железной стойки балкона, она интенсивно сокращалась. Гальвани заключил, что внутри мышцы имеется положительный заряд, а на ее поверхности – отрицательный. Поэтому, когда внутренняя ее поверхность через нерв и металлический проводник соединяется с наружной, происходит разряд «животного электричества», который вызывает сокращение мышцы.

Оппонентом Гальвани выступил известный физик Алессандро Вольта, который причину возникновения электрического тока видел не в мышце, а в металле. Вольта обнаружил, что опыт Гальвани особенно хорошо получался, когда к препарату прикладывалась металлическая дуга из двух спаянных на одном конце разнородных металлов. На свободных концах такой дуги возникает достаточно большая «контактная разность потенциалов», которая и раздражает препарат.

В ответ Гальвани поставил второй опыт, где нерв препарата набрасывался на поврежденную (разрез) и неповрежденную поверхность мышцы того же или другого препарата и мышца сокращалась. Так было доказано существование электрических потенциалов в живых тканях.

Через 50 лет Маттеучи воспроизвел опыты Гальвани и дал им более убедительное обоснование. Он использовал два нервно-мышечных препарата. Нерв 2-го препарата накладывался на мышцу 1-го. При раздражении нерва 1-го препарата сокращались обе мышцы. Т.е. электрические изменения, возникающие в 1-й мышце при раздражении нерва, раздражали нерв 2-го препарата. Кроме того, Маттеучи показал, что наружная поверхность мышцы заряжена электроположительно по отношению к ее внутреннему содержимому.

«Отцом» электрофизиологии считают немецкого физиолога Дюбуа-Реймона. Он создал первую теорию биоэлектрических явлений в живых тканях, использовал приборы для регистрации «животного электричества».

Первые оригинальные исследования по электрофизиологии в России относятся к 1875 году, когда Данилевский записал первую электроэнцефалограмму. В настоящее время электрофизиология – один из ведущих методов физиологии.

В 19 в. было установлено, что сигналы, возникающие в нервных клетках и других возбудимых тканях, обусловлены электрическими свойствами клеточных мембран.

Согласно жидкостно-мозаичной модели, мембрана представлена бислоем фосфолипидных молекул, ориентированных таким образом, что гидрофобные концы молекул находятся внутри бислоя, а гидрофильные направлены в водную фазу. Такая структура идеально подходит для образования раздела двух фаз: вне- и внутриклеточной.

В фосфолипидном бислое интегрированы глобулярные белки, полярные участки которых образуют гидрофильную поверхность в водной фазе. Эти белки выполняют различные функции, в том числе рецепторную, ферментативную, образуют ионные каналы, являются мембранными насосами и переносчиками ионов и молекул.

Особая морфология клеточных мембран определяет их электрические характеристики, среди которых наиболее важными являются емкость и проводимость.

Емкостные свойствав основном определяются фосфолипидным слоем, который непроницаем для гидратированных ионов и в то же время достаточно тонок (около 5 нм), чтобы обеспечивать эффективное разделение и накопление зарядов и электрическое взаимодействие катионов и анионов. Кроме того, емкостные свойства клеточных мембран являются одной из причин, определяющих временные характеристики электрических процессов, протекающих на клеточных мембранах.

Проводимость(g) – величина, обратная электрическому сопротивлению и равная отношению величины общего трансмембранного тока для данного иона к величине, обусловившей его трансмембранную разность потенциалов.

Через фосфолипидный бислой могут диффундировать различные вещества, причем степень проницаемости (Р) зависит от разности концентраций диффундирующего вещества по обе стороны мембраны, его растворимости в липидах и свойств клеточной мембраны. Проводимость мембраны является мерой ее ионной проницаемости. Увеличение проводимости свидетельствует об увеличении количества ионов, проходящих через мембрану.

Строение и функции ионных каналов.Ионы натрия, калия, кальция и хлора проникают внутрь клетки и выходят наружу через специальные, заполненные жидкостью каналы. Размер каналов не превышает 0,5-0,7 нм и суммарная площадь каналов занимает незначительную часть поверхности мембраны. Одни каналы специфичны, т.е. пропускают только один тип ионов, другие не обладают строгой селективностью и могут пропускать несколько ионов. В настоящее время установлены многие типы каналов для различных ионов. Важнейшими являются:

– калиевый (в покое), его функция – генерация потенциала покоя, формирует ток утечки (I_К⁺), блокатором является тетраэтиламмоний (ТЭА);

– натриевый - генерация ПД, I_NA⁺, тетродотоксин (ТТХ);

– кальциевый – генерация медленных потенциалов, I_Ca²⁺ , верапамил, D-600;

– калиевый (задержанное выпрямление) – обеспечение реполяризации, I_К⁺ (задержка), ТЭА;

– калиевый кальций-активируемый – ограничение деполяризации, обусловленной током Са²⁺ , I_К⁺ Ca²⁺, ТЭА.

Именно ионные каналы обеспечивают два важных свойства мембраны: селективность и проводимость.

Селективность, или избирательность, канала обеспечивается его особой белковой структурой (например, натриевые каналы могут пропускать также литий, но в норме при возникновении нервных импульсов через эти каналы проходит именно натрий). Большинство каналов являются электроуправляемыми, т.е. их способность проводить ионы зависит от величины мембранного потенциала. Срабатывание других зависит от связывания с особыми рецепторными участками мембраны молекул медиаторов или мессенджеров. Функционирование каналов в клетках рецепторов зависит от воздействия специфических раздражителей.

Канал неоднороден по своим функциональным характеристикам, особенно это касается белковых структур – воротных механизмов, находящихся у входа канала и у его выхода.

Принцип работы каналов можно рассмотреть на примере Na-канала. В состоянии покоя натриевый канал закрыт (закрыты m-ворота). При деполяризации мембраны до определенного уровня происходит открытие m-активационных ворот (активация) и усиление поступления Na внутрь клетки. Через несколько мсек после открытия активационных ворот происходит закрытие инактивационных h-ворот, расположенных у выхода канала (инактивация). Инактивация (рефрактерность) Na-каналов устраняется после реполяризации. Таким образом, в состоянии покоя и инактивации канал является непроводящим, однако эти два состояния существенно отличаются. В покое канал закрыт, но он может быть открыт деполяризующим стимулом. При инактивации канал закрыт и уже но может быть переведен в проводящее состояние путем дополнительной деполяризации мембраны. Для его открытия необходимо прекратить деполяризацию и вернуть мембрану к состоянию покоя.

Ходжкин и Хаксли сформулировали принцип «независимости» каналов, согласно которому потоки натрия и калия через мембрану независимы друг от друга.

Свойство проводимости различных каналов неодинаково. В частности, для калиевых каналов процесса инактивации, как для натриевых каналов, не существует. Имеются особые калиевые каналы, активирующиеся при повышении внутриклеточной концентрации кальция и деполяризации клеточной мембраны. Активация калий-кальцийзависимых каналов ускоряет реполяризацию, тем самым восстанавливая исходное значение потенциала покоя.

Особый интерес представляют собой кальциевые каналы.

Входящий кальциевый ток, как правило, недостаточно велик, чтобы нормально деполяризовать клеточную мембрану. Чаще всего поступающий в клетку кальций выступает в роли «мессенджера», или вторичного посредника. Активация кальциевых каналов обеспечивается деполяризацией клеточной мембраны, например входящим натриевым током.

Процесс инактивации кальциевых каналов достаточно сложен. С одной стороны, повышение внутриклеточной концентрации свободного кальция приводит к инактивации кальциевых каналов. С другой стороны, белки цитоплазмы клеток связывают кальций, что позволяет длительное время поддерживать стабильную величину кальциевого тока, хотя и на низком уровне; при этом натриевый ток полностью подавляется. Кальциевые каналы играют существенную роль в клетках сердца.

Несмотря на то, что открытие Гольджи и Маттеучи об электрической природе нервного импульса было сделано более 200 лет назад, механизм возникновения и распространения импульсов был открыт после того, как у кальмара были обнаружены гигантские аксоны толщиной около мм.

Детальный анализ процессов, протекающих в мембранах возбудимых клеток, проведенный Ходжкиным, Хаксли и Катцем в опытах на гигантском аксоне кальмара, показал, что по обе стороны мембраны, между содержимым клетки и внеклеточной жидкостью, обычно существует разность потенциалов – мембранный потенциал (МП). МП оказывает влияние на процессы трансмембранного обмена веществ и в этом отношении важен, например, для функции эпителия почечных канальцев. В нервных и мышечных клетках изменения мембранного потенциала составляют основу деятельности клетки – переработки информации и процесса сокращения.

Для регистрации МП используют микроэлектрод – стеклянный капилляр с очень тонким кончиком (меньше 1 мкм), заполненный проводящим ток раствором (KCl). Референтным электродом во внеклеточной среде служит хлорированная серебряная пластинка. Когда оба электрода находятся во внеклеточной среде, разности потенциалов между ними нет:

Когда отводящий электрод проходит через клеточную мембрану в клетку, вольтметр регистрирует скачкообразный сдвиг потенциала примерно до –80 мВ. Этот сдвиг и соответствует МП:

В покоящейся нервной или мышечной клетке МП долго сохраняется постоянным. Он называется потенциалом покоя (ПП). ПП нервной и мышечной клетки всегда отрицательный, его величина постоянна для каждого типа клеток. У теплокровных ПП составляет от – 70 до – 95 мВ. Низкий ПП (-30 мВ) характерен для гладкомышечных клеток.

ПП имеет физико-химическую природу и обусловлен разностью ионных концентраций по обе стороны мембраны аксона и избирательной проницаемостью мембраны для ионов.

В водных солевых растворах, которые составляют внутри- и внеклеточную среду, электрические заряды переносятся ионами – молекулами солей, диссоциирущими на анионы и катионы. Они могут свободно перемещаться в водном растворе, так что во внутриклеточном или внеклеточном пространстве заряды распределены равномерно, однако между обеими жидкостями существуют электрохимические ионные градиенты. Таким образом, мембрана служит местом нарушения баланса зарядов, которое лежит в основе ПП.

Во внутриклеточной среде в 20 -50 раз больше ионов К и в 5-15 раз меньше ионов Na, чем в межклеточной жидкости. Распределение концентрации ионов Cl^- обратно распределению ионов K⁺: в клетке его в 20 -50 раз меньше, чем вне клетки. Большинство внутриклеточных анионов составляют крупные ионы белков (A^-) (таблица).

Внутри- и внеклеточные концентрации ионов для мышечной клетки, ммоль/л

Внутриклеточная Внеклеточная

Na 12 145

K 155 4

Cl 4 120

HCO₃ 8 27

A 155 Другие анионы 7

МП – 90 мВ Другие катионы 5

В опытах с использованием изотопов калия и натрия было показано, что в невозбужденном состоянии клеточная мембрана высокопроницаема для ионов К и малопроницаема для ионов Na. Разность концентраций ионов калия вне и внутри клетки и высокая проницаемость клеточной мембраны для ионов К обеспечивает диффузионный ток (утечку) этих ионов из клетки наружу и накопление избытка положительных ионов К на наружной стороне клеточной мембраны, что препятствует дальнейшему выходу ионов К из клетки. Диффузионный ток ионов калия существует до тех пор, пока их движение по концентрационному градиенту не уравновесится разностью потенциалов на мембране. Эта разность потенциалов называется калиевым равновесным потенциалом.

Равновесный потенциал (для соответствующего иона, Е_К) – разность потенциалов между внутренней средой клетки и внеклеточной жидкостью, при которой вход и выход иона уравновешен (химическая разность потенциалов равна электрической).

Таким образом, калиевый равновесный потенциал определяется отношением концентраций Ko/Ki между внешней (outside) и внутренней (inside) средой клетки, а также тем, что диффузия через мембрану ограничивается только ионами K⁺. Такие диффузионные потенциалы описываются уравнением Нернста:

Где R – газовая постоянная, T – абсолютная температура, n– валентность иона (отрицательная для анионов), F – постоянная Фарадея.

Важно подчеркнуть следующие два момента: 1) состояние равновесия наступает в результате диффузии лишь очень небольшого количества ионов (по сравнению с их общим содержанием); 2) калиевый равновесный потенциал всегда больше (по абсолютному значению) реального потенциала покоя, т.к. мембрана в покое не является совершенным изолятором, в частности, имеется небольшая утечка ионов натрия.

Разность между текущим значением мембранного потенциала, (МП) и Е_К называют электрохимическим градиентом для ионов К. Этот градиент – причина пассивного движения К через мембрану в естественных условиях. Т.к. концентрация ионов калия вне клетки меньше, чем внутри, Ек будет отрицательным.

По такому же принципу может быть рассчитан электрохимический градиент для ионов натрия, хлора или кальция. МП гигантского аксона кальмара (-70 мВ) близок к его Ек (-75 мВ), но не точно равен ему, т.к. МПП формируется не только утечкой ионов К, но и утечкой натрия и хлора. При этом поступление хлора в аксон (Е_Cl=-70 мВ) повышает, а Na+ - понижает МПП (Е_Na=+55 мВ).

Итоговая величина Е, создаваемого утечкой K, Na и Cl, может быть достаточно точно рассчитана по формуле Гольдмана:

,

где Р – проницаемость мембраны для соответствующих ионов (ее часто выражают в относительных единицах, принимая Р_К за 1). Для мембраны аксона кальмара в покое отношение Р_K:P_Na:P_Cl = 1:0,04:0,45.

Поскольку мембраны живых клеток в той или иной степени проницаемы для всех ионов, очевидно, что без специальных механизмов невозможно поддерживать постоянную разность концентрации ионов (ионную асимметрию). В клеточных мембранах существуют специальные системы активного транспорта, работающие с затратой энергии и перемещающие ионы против градиента концентраций. Экспериментальным доказательством существования таких механизмов служат результаты опытов, в которых активность АТФ-азы подавлялась, например сердечным гликозидом оуабаином. При этом происходило выравнивание концентраций К вне и внутри клетки и МП уменьшался до 0.

Важнейшим механизмом поддержания низкой концентрации ионов натрия внутри клетки и высокой концентрации калия является натрий-калиевый насос. В клеточной мембране имеется система переносчиков, каждый из которых связывается с 3 находящимися внутри клетки ионами натрия и выводит их наружу. С наружной стороны переносчик связывается с 2 находящимися вне клетки ионами калия, которые переносятся в цитоплазму.

Роль насоса заключается в следующем:

1) За один цикл обмена ионов из клетки выводится на 1 ион больше, чем вводится, таким образом активный транспорт играет определенную роль в создании ПП (электрогенный насос).

2) Поддерживается низкая концентрация натрия внутри клетки, что обеспечивает работу механизма генерации ПД, и обеспечивает сохранение осмолярности и объема клетки.

3) Поддерживается стабильный концентрационный градиент натрия, что способствует сопряженному транспорту аминокислот и сахаров через клеточную мембрану.

Таким образом, возникновение трансмембранной разности потенциалов (ПП) обусловлено высокой проводимостью клеточной мембраны в состоянии покоя для ионов К (для мышечных клеток и ионов хлора), ионной асимметрией концентраций для ионов К (для мышечных клеток и для ионов хлора), работой систем активного транспорта, которые создают и поддерживают ионную асимметрию.

Потенциал действия

Емкость мембраны и работа метаболических ионных насосов приводят к накоплению потенциальной электрической энергии на клеточной мембране в форме потенциала покоя. Эта энергия может освобождаться в виде специфических электрических сигналов (ПД), характерных для возбудимых тканей: нервной, мышечной, некоторых рецепторных и секреторных клеток. Потенциал действия это быстрое колебание ПП, сопровождающееся, как правило, перезарядкой мембраны.

При стимуляции аксона электрическим током потенциал на внутренней поверхности мембраны меняется с – 70 мВ до + 40. Это изменение полярности носит название потенциала действия (спайка), который регистрируется на осциллографе в виде характерной кривой.

Каждый тип клеток имеет постоянный и характерный для данного типа временной ход ПД. Он практически не зависит от частоты возбуждения клетки. Так как форма ПД постоянна, говорят, что возбуждение протекает по закону «все или ничего».

Анализ ионной природы ПД установил, что фронт нарастания ПД и перезарядка мембраны (овершут) обусловлены движением ионов натрия внутрь клетки. Натриевые каналы являются электроуправляемыми, и деполяризующий толчок тока приводит к их активации и увеличению натриевого тока. При развитии пика ПД отношение Рк:Р_Na:Р_Cl становится равным 1:20:0,45.

Вход ионов натрия в волокно обеспечивает восходящую фазу пика ПД. Число положительно заряженных ионов внутри клетки возрастает, и мембранный потенциал снижается. Такое изменение мембранного потенциала называется деполяризацией.

Возникновению ПД предшествуют в точке раздражения нерва или мышцы активные подпороговые изменения МП, проявляющиеся в форме так называемого локального (местного ответа), для которого характерна зависимость от силы раздражения, постепенное нарастание величины ответа и нераспространение по нервному волокну. Первые признаки локального ответа проявляются при силе стимула в 50-75 % от пороговой. Локальный ответ, как и ПД, обусловлен повышением натриевой проницаемости, однако оно недостаточно для генерации ПД (рис.)

Повышение натриевой проводимости и деполяризация влияют друг на друга по принципу положительной обратной связи, т.е. взаимно усиливают друг друга, и в результате возникает фаза крутого подъема ПД.

Уровень потенциала, при котором деполяризация дает начало ПД, называется порогом или критическим уровнем деполяризации (КУД). При пороговом потенциале заряд мембраны становится нестабильным; он нарушается, происходит реверсия полярности. Это состояние и называется возбуждением.

Как правило, деполяризация переходит за нулевую линию, и МП становится положительным. Эта положительная фаза называется овершутом.

На пике ПД проводимость мембраны для ионов натрия начинает быстро снижаться (натриевые каналы инактивируются) и проницаемость для Na начинает падать. Скорость и степень натриевой инактивации потенциалзависимы, т.е. зависят от величины МП. При постепенном уменьшении МП до -50 мВ (например, при недостатке кислорода, действии некоторых лекарств) система натриевых каналов полностью инактивируется и клетка становится невозбудимой.

После достижения пика ПД происходит реполяризация, и МП возвращается к исходному значению. Развитие ПД и перезарядка мембраны приводят к тому, что внутриклеточный потенциал становится еще более положительным, чем равновесный калиевый потенциал, и, следовательно, электрические силы, перемещающие ионы калия через мембрану, увеличиваются. Максимума эти силы достигают на пике ПД. Кроме тока, обусловленного пассивным передвижением ионов калия, был обнаружен задержанный выходящий ток, который также переносился ионами калия. Этот ток достигает максимума через 5-8 мс от начала генерации ПД. По мере выхода ионов К положительный заряд с внутренней стороны мембраны меняется на отрицательный. Эта фаза реполяризации мембраны, представленная нисходящей областью пика ПД, приводит к восстановлению МП (т.обр., если ПП определяется главным образом ионами К, то ПД зависит в основном от ионов Na).

Последний участок фазы реполяризации для некоторых видов ПД бывает замедлен (ПД мышцы). Примерно через 1 мс после начала ПД наблюдается отчетливый перегиб кривой реполяризации; следующее за ним медленное изменение потенциала называется деполяризационным следовым потенциалом. В некоторых тканях (например, нейронах спинного мозга), кривая деполяризации быстро пересекает уровень ПП, так что на некоторое время потенциал становится более отрицательным, чем ПП. Это явление называется гиперполяризационным следовым потенциалом. Он может быть связан с тем, что задержанный выходящий калиевый ток существует некоторое время после генерации ПД, а также с работой натриевого-электрогенного насоса. (рис.2.12)

Длительность ПД составляет около 1 мс в нервах, 10 мс в скелетной мышце и больше 200 мс в миокарде.

Инактивация натриевой системы в процессе генерации ПД приводит к том у, что клетка в этот период не может быть повторно возбуждена, т.е. наблюдается состояние абсолютной рефрактерности.

Постепенное восстановление ПП в процессе реполяризации дает возможность вызвать повторный ПД, но для этого требуется сверхпороговый стимул, т.к. клетка находится в состоянии относительной рефрактерности.

Исследование возбудимости клетки во время ЛО или во время отрицательного (деполяризационного) следового потенциала показало, что генерация ПД возможна при действии подпорогового стимула. Это состояние супернормальности, или экзальтации. Длительность периода абсолютной рефрактерности ограничивает максимальную частоту генерации ПД данным типом клеток. Например, при продолжительности периода абсолютной рефрактерности 4 мс максимальная частота составит 250 Гц.

Н.Е.Введенский ввел понятие лабильности, или функциональной подвижности, возбудимых тканей. Мерой лабильности является количество ПД, которое способна генерировать возбудимая ткань в единицу времени. Очевидно, что лабильность, в первую очередь, определяется продолжительностью рефрактерного периода. Наиболее лабильными являются волокна слухового нерва, в которых частота генерации ПД достигает 1000 Гц.

Таким образом, генерация ПД в возбудимых мембранах возникает под влиянием различных факторов и сопровождается повышением проводимости клеточной мембраны для ионов натрия, входом их внутрь клетки, что приводит к деполяризации клеточной мембраны и появлению ЛО. Этот процесс может достигнуть КУД, после чего проводимость мембраны для натрия увеличивается до максимума, МП при этом приближается к натриевому равновесному потенциалу. Через несколько мс происходит инактивация натриевых каналов, активация калиевых каналов, увеличение выходящего калиевого тока, что приводит к реполяризации и восстановлению исходного ПП.