ГЛАВА 16. ферментативной активности на 1 л культуры, т

ферментативной активности на 1 л культуры, т. е. до 4 800 000 ЕД в сутки. С учетом того что после очистки фермента уровень активности уменьшается до 20% и что стоимость единицы активности равна примерно 0,25 долларов, получаем, что ежедневно можно синтезировать количество фермента на сумму 240 000 долларов. Мы не учли всех затрат на само производство белка, однако ясно и так, что прибыль от реализации ценных продуктов, полученных при непрерывной ферментации в биореакторах малого или среднего размера, значительно превышает затраты.

Двухступенчатая ферментация в одном реакторе с механическим перемешиванием

Трехкомпонентный рекомбинантный белок AGßgal, использующийся при проведении иммунологических тестов, синтезировали в промышленных масштабах в одном биореакторе с механическим перемешиванием. Ген этого белка был сконструирован методами генной инженерии и содержал сегменты, кодирующие пять сайтов связывания иммуноглобулина G (JgG) А-белка Staphylacoccus aureus, два сайта связывания IgG G-белка штамма G148 Streptococcus и ß-галактозидазу Е. coli. Он находился под контролем промотора p^R бактериофага λ, регуляция которого осуществляется так же, как регуляция p^L-промотора, и был встроен в плазмиду, несущую ген устойчивости к ампициллину; этой конструкцией трансформировали клетки Е. соli. Штамм с плазмидой, несущей ДНК AGßgai, содержал вторую плазмиду, несущую ген температурочувствительного белка-репрессора сIи ген устойчивости к канамицину.

Культуру в объеме 5 л выращивали при 30 °С в присутствии ампициллина и канамицина, с тем чтобы обеспечить условия для сохранения обеих плазмид, а затем использовали в качестве посевного материала для инициации роста культуры без антибиотиков при 30 °С в реакторе с рабочим объемом 45 л. Суспензия клеток из 45-литрового ферментера в свою очередь служила посевным материалом для культивирования в биореакторе на 600 л, в котором клетки продолжали выращивать при 30 'С без антибиотиков (рис. 16.6). (Вообще говоря, для уменьшения стоимости процесса антибиотики при крупно-

Рис. 16.6. Схематическое представление промышленного синтеза белка AGßgai. В скобках указан объем культуральной среды на каждом этапе. На ее долю приходится от 60 до 75% объема соответствующих биореакторов (ферментеров).

масштабном культивировании в среду не добавляют.) Как только плотность культуры в биореакторе на 600 л достигала примерно 4 г/л, температуру повышали с 30 до 40 °С, чтобы индуцировать экспрессию гена белка AGßgal. На повышение температуры в этих условиях уходило около часа. Индукцию проводили при 40, а не при 42 °С, по-

Промышленный синтез белков при участиирекомбинантныхмикроорганизмов 363

скольку при более низкой температуре синтезировалось такое же количество белка AGßgal, но клетки могли расти в течение более длительного периода. Иными словами, при более низкой температуре индукции {40 °С) выход белкового продукта был больше.

Удельная активность белка AGßgal в течение 2 ч после начала индукции повышалась, а затем снижалась. Возможно, это было связано с синтезом протеаз клетками, перешедшими в фазу замедленного роста или в стационарную фазу. Кроме того, примерно 50% клеток, росших в течение 4 ч при 40 °С, утратили плазмиду. Но даже при этом после 4-часового культивирования при 40 °С на долю AGßgal-белка приходилось примерно 20% всей массы сухого вещества. Учитывая все это, можно не интегрировать гены белка AGßgal и репрессора cl в хромосомную ДНК хозяйской клетки Е, coli с целью увеличения выхода продуктов.

Периодическая ферментация и периодическая ферментация с добавлением субстрата

В некоторых случаях для достижения высокой плотности культуры и получения больших количеств продукта достаточно проводить ферментацию в обычном периодическом режиме. В одном из экспериментов плазмиду, несущую ген гибридного белка, одним из компонентов которого был пептид инсулина В, помещали под контроль trp-промотора E, соli и вводили в trp^~-штамм Е. соli; трансформированные клетки

культивировали в среде с разным содержанием триптофана. При высоких концентрациях последнего гибридный белок не синтезировался; последующее поглощение триптофана из среды растущими клетками приводило к индукции синтеза необходимого белка. Добавление триптофана в среду приводило к увеличению количества как биомассы, так и синтезируемого белка, а использование периодических ферментеров с добавлением постоянного количества субстрата еще более усиливало этот эффект (табл. 16.1).

Сбор клеток

Чтобы очистить продукт ферментации, нужно прежде всего отделить клетки от культуральной среды. Сбор генетически модифицированных и исходных, нетрансформированных клеток можно проводить одними и теми же методами. Однако трансформированные клетки часто обладают другими физиологическими свойствами (они имеют другой размер или синтезируют внеклеточные полисахариды), и в результате условия, оптимальные для сбора нетрансформированных клеток, могут не подходить для клеток, синтезирующих чужеродный белок.

Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды часто используют высокоскоростное центрифугирование. Для этого сконструированы специальные высокоскоростные центрифуги полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан работающей центрифуги, клетки концент-

Таблица 16. 1. Синтез рекомбинантного белка, одним из компонентов которого является пептид инсулина В, при периодической ферментации и при периодической ферментации с добавлением субстрата1)2)
Конечный показатель	Выход
1) Поданным работы Cosset et al,, AppL MikrobioL Biotechnol. 39; 541-546, 1993. 2) Количество биомассы измеряется в граммах сухого вещества на литр культуры. Процедура «Периодическая ферментация + Тrр» означает, что к культуре добавлено 0,1 г триптофана. При периодической ферментации с добавлением субстрата в среду добавляли 0,1 г триптофана каждые 2 ч — в обшей сложности пять раз в течение 10 ч. При добавлении большего количества триптофана не увеличивались ни биомасса, ни количество синтезированного белка.