Цитогенетический метод.

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании хромосом -кариотипа (индивидуального набора хромосом) и полового хроматина. Позволяет выявлять

1.геномные мутации:

а) полиплоидии,

б) анеуплоидии - трисомии 2п + 1 (с. Дауна, Эдварса, Патау, Клайнфельтера),

- моносомии 2п - 1 (Тернера - Шерешевского),

- нулисомии 2п -2

в) мозаицизм 46/45 хромосом в группах клеток

2. хромосомные абберации –

-транслокации (с. Дауна),

- делеции (с. «Кошачьего крика», Вольфа - Хиршхорна)

3. микрохромосомные перестройки при моногенных синдромах (филадельфийская хромосома - делеция 21 хромосомы - миелолейкоз - белокровие)

Этапы цитогенетического метода:

• подбор клеточного материала,

• культивирование соматических клеток на искусственных питательных средах (клетки человека быстро размножаются на питательных средах)

• добавление ФГА - фитогемагглютинина - стимулятора митоза,

• добавление колхицина - мутагена разрушающего веретено деления во время митоза, для остановки митоза на стадии метафазы

• обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие хромосомы набухают, рассыпаются и лежат свободно

• окрашивание хромосом

• изучение под микроскопом, фотографирование

• вырезание и построение идеограммы

Основные сведения о морфологии хромосом человека получены при изучении их в метафазахмитоза прометафазе-метафазе мейоза. При этом важно, чтобы количество делящихся клеток, было достаточно велико.

Подбор клеточного материала. Культивирование

Препараты хромосом можно приготовить извсех тканейи клеточных суспензий, содержащих делящиеся клетки. У человека в большинстве случаев используютпрепараты из клеток костного мозга, кратковременной культуры крови или из длительной культуры фибробластовкожи. Используют биоптаты семенников, спущенныеэмбриональные клетки плода (аминиоцентез), плацетобиопсия (биопсия плода- хорионобиопсия и плаценты).

Наиболее простым и доступным методом является культивирование клетоккрови. Пункция костного мозга или биопсия кожи для культивирования фибробластов технически сложнее, и к тому же аспирация костного мозга- весьма неприятная процедура. Препараты из костного мозга имеют, однако, то преимущество, что дают возможность изучать митозы in vivo, вне культуры клеток, а сразу после взятия материала у пациента.

В крови здоровых людей нет делящихся клеток. Однако митоз этих клеток можно стимулировать искусственно, обработав их стимулятором митоза фитогемагглютинином ФГА. Берут один миллилитр периферической крови. Суспензию лейкоцитов выращивают в культуральной среде in vitro 72 часа и затем готовятпрепараты хромосом. Чтобы остановить клетки в прометафазе. подавляют образование веретена деления веществами с колхицином. Для свободного распределения хромосом в плоскости препарата клеткиобрабатывают гипотоническим раствором. Затем каплю суспензии наносят на стекло и окрашивают.

Окрашивание.

Наиболее простой способ окрашивания - простая рутинная сплошная по всей длине хромосомы основным (щелочным) красителем Гимза или 2% - ным ацстоорссином или ацегкармином. Эти красители окрашивают хромосомы целиком, равномерно и интенсивно. Для выявления численных аномалий хромосом этот метод вполне достаточен.

Для получения более детальной картины структурыхромосом или их сегментов используют различные способы дифференциального окрашивания. Методы дифференциальной окраски хромосом основаны на действии солевых растворов с определённым Ph, температурным режимом, обработкой ферментами Протеазами.Этими методами установлена четкая структурная разнородность хромосом по длине на красящиеся (тёмные- гетерохроматин) и некрасящиеся (светлые - эухроматин) полосы. Рисунок этих полос специфичен, индивидуален для каждой пары хромосом. Рисунок сегментациизависит от особенностей неоднородности целостного комплекса ДНК - белок в разных участках по длине хромосом. Различные типы сегментов обозначают по методам,с помощью которых они выявляютсянаиболее отчетливо. Способы дифференциального окрашивания: Q, G, R, С, Т - окрашивание.