ТЕХНОЛОГИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ

Источниками ферментов являются растительные материалы - пророщенное зерно злаков (солод); органы и ткани животных - поджелудочная железа, слизистые оболочки желудков, сычуги крупного рогатого скота; а также микроорганизмы - бактерии, грибы, дрожжи, актиномицеты.

По современной классификации идентифицировано более 2000 ферментов. В промышленных условиях производят около 250 наименований ферментных препаратов, но 99% всей продукции приходится только на 18 ферментов. В мировой практике в наибольших масштабах производятся протеиназы, широко используемые в синтетических моющих средствах, и амилазы для переработки крахмала. На их долю приходится до 65% общего объема выпуска ферментных препаратов.

Ферменты применяются в ряде отраслей: в пищевой промышленности - пивоварение и виноделие, хлебопечение, сыроделие, производство соков и глюкозо-фруктозных сиропов; в текстильной промышленности; в кожевенной промышленности - обезволашивание и мягчение кож; в медицине - при лечении воспалительных процессов, ожогов, тромбозов; в сельском хозяйстве - для обработки грубых кормов; в аналитической химии; органическом синтезе; генетической инженерии.

Ферменты как биокатализаторы обладают высокой активностью и избирательностью действия. В ряде случаев ферменты характеризуются абсолютной специфичностью. Для каждого фермента существует оптимальная область величины рН, в которой его каталитическое действие максимально. Повышение температуры ускоряет ферментативную реакцию, но многие ферменты при температуре более 40–50°С инактивируются (денатурируют).

В международной практике за стандартную единицу активности фермента принимают количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин в стандартных условиях. По требованиям стандарта активность определяют при температуре 30°С по начальной скорости реакции, остальные условия реакции индивидуальны для каждого фермента. Активность ферментного препарата выражают в условных единицах активности, приходящихся на 1 мл ферментного раствора или 1 г препарата. В производственной практике пользуются понятием условная тонна ферментного препарата, под которой понимают 1 т товарного препарата со стандартной активностью.

Наибольший интерес в качестве источника ферментов представляют микроорганизмы, поскольку для них характерна высокая интенсивность функционирования ферментных систем при большой скорости прироста биомассы. Получение ферментных препаратов из клеток микроорганизмов, и особенно из культуральной среды, намного экономичнее, чем из растительных и животных тканей. Некоторые ферменты обнаружены только у микроорганизмов: рацемазы; кератиназы, гидролизующие белки-кератины, входящие в состав волос, перьев, рогов и копыт; нитрогеназы, участвующие в восстановлении молекулярного азота до аммиака, и др. Некоторые микроорганизмы, способные расти при повышенной температуре (45–80°С), образуют термостабильные ферменты, сохраняющие активность при температуре более 70°С.

Многие микробные ферменты уникальны по своей активности в кислых и щелочных средах: кислые протеазы стабильны при рН 1,5-3,5, а щелочные проявляют высокую активность при рН больше 8,0. И, наконец, известно, что ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но полученные из разных микроорганизмов, могут существенно различаться по свойствам.

Микроорганизмы способны синтезировать самые разнообразные ферменты: амилолитические, протеолитические, пектолитические, целлюлолитические, липолитические и др. Основными поставщиками ферментов микробного происхождения являются грибы (Aspergillus, Penicillium, Fusаrium, Rhizopus). В последнее время все более широкое применение находят ферменты бактерий (Bacillus, Escherihia), дрожжей и дрожжеподобных грибов (Candida, Endomycopsis, Saccharomyces). Для промышленного получения ферментных препаратов используют как природные штаммы, так и мутанты. Микроорганизмы синтезируют комплекс ферментов с преимущественным накоплением какого-либо фермента, но среди мутантных штаммов имеются «моноферментные» продуценты, способные продуцировать преимущественно один определенный фермент.

Промышленные препараты ферментов содержат балластные вещества и имеют разную степень чистоты. Наименование препарата складывается из сокращенного названия основного фермента и видового названия продуцента. Например: протосубтилин - основной фермент протеиназа, продуцент - Bacillus subtilis; глюкаваморин - глюкоамилаза, Aspergillus awamori; амилосубтилин - амилаза, Bacillus subtilis; пектофоетидин - пектиназа, Aspergillus foetidus; амилоризин - амилаза, Aspergillus oryzae. В наименовании препарата указывается также способ культивирования микроорганизма (П - поверхностный, Г - глубинный) и индекс, характеризующий степень очистки препарата, в виде цифры перед буквой «х» (х, 2х, 3х, 10х и т. д.). Чем больше цифра перед буквой «х», тем выше степень очистки препарата:

- Пх, Гх - исходная культура продуцента без какой-либо очистки;

- П2х, Г2х - жидкий концентрат растворимых веществ исходной культуры (40-50% сухого вещества), освобожденный от нерастворимых веществ;

- П3х, Г3х - сухие ферментные препараты, полученные сушкой экстракта поверхностной культуры или жидких концентратов П2х, Г2х;

- П10х, Г10х - сухие препараты, полученные осаждением ферментов из водных растворов органическим растворителем или высаливанием;

- П20х, Г20х - высокоочищенные, но не кристаллические ферментные препараты, содержащие до 25% балластных веществ.

Препараты ферментов с индексом 10х и выше относят к очищенным, с меньшей величиной индекса - к техническим.

В производственных условиях продуценты ферментов культивируют как глубинным, так и поверхностным методом. Независимо от способа культивирования продуцента характерным свойством многих ферментов является их индуцибельность. Индуктором биосинтеза ферментов чаще всего является субстрат, на который данный фермент действует, а также продукты частичного гидролиза или некоторые аналоги субстрата. Например, индуктором биосинтеза амилаз является крахмал, пектиназ - пектиновые вещества.

Поверхностное культивирование продуцентов ферментов (мицелиальных грибов) базируется на использовании кюветного способа. Открытые кюветы (600 ´ 800 ´ 30 мм) с перфорированным днищем располагаются ярусами высотой до двух метров на стационарных стеллажах или подвижных этажерках, которые размещаются в растильной камере объемом 90 м³ (3 ´ 3 ´ 10 м). Растильная камера оборудована кондиционером для стабилизации параметров (температуры и влажности) подаваемого в камеру воздуха. Расход воздуха рассчитывают не только на обеспечение растущих грибов кислородом, но и на отвод выделяемого ими биологического тепла.

Основным компонентом среды при поверхностном культивировании являются пшеничные отруби, содержащие все необходимые питательные вещества для роста и развития грибов. Для повышения активности ферментов в питательную среду вводят различные добавки: свекловичный жом (индуктор синтеза пектолитических ферментов), соевую муку (индуктор протеаз), пивную дробину или солодовые ростки (индуктор амилаз), овсяную шелуху, древесные опилки (разрыхлители среды). Питательную среду стерилизуют в шнековом стерилизаторе, обогреваемом глухим паром.

Оптимальная для продуцирования ферментов влажность среды - 55–70%. Чрезмерное увлажнение нарушает рыхлую структуру среды, уменьшает доступ кислорода к культуре и замедляет биосинтез. Низкая влажность способствует ускоренному переходу культуры к спорообразованию, что используют при получении посевного материала.

Посевной материал представляет собой поверхностную культуру, выращенную на твердой среде, споровый материал или мицелиальную массу продуцента, полученную глубинным культивированием. Посевную поверхностную культуру получают выращиванием гриба во все возрастающем количестве в 3 или 4 этапа: в пробирке с 1,0–1,5 г стерильных отрубей, в колбах со 100 г той же среды, в колбах (банках) с 300–500 г среды и в посевных кюветах. На всех этапах выращивание осуществляют при температуре (28±2)°С до обильного спорообразования. Чтобы продлить срок хранения, посевную культуру подсушивают до влажности 10–12% продувкой воздухом в растильной камере и хранят в полиэтиленовых пакетах при 4–6°С.

Для получения спорового материала в специальном вибросепараторе потоком воздуха отделяют конидии от основной массы поверхностной культуры. Мицелиальную массу получают культивированием гриба на жидкой среде в инокуляторе.

Выращивание поверхностной культуры длится 36–48 ч. За этот период гриб проходит три стадии роста. Первая стадия (10–12 ч) - набухание конидий и их прорастание. На этой стадии воздухообмен в камере составляет 4–5 объемов в час, температура воздуха 28°С. Вторая стадия (14–18 ч) - активный рост мицелия, сопровождающийся выделением большого количества тепла (около 4000 кДж/кг культуры). В растильную камеру подают 40–60 объемов воздуха в час при температуре 26–28°С. Третья стадия (12–18 ч) характеризуется замедлением процессов обмена при еще активном образовании ферментов и начале образования конидий. Воздухообмен уменьшают в 3-5 раз по сравнению со второй стадией. По завершении третьей стадии в растильную камеру подают воздух с температурой 38–40°С и в течение 3–6 ч подсушивают культуру до влажности 45–35%, что облегчает отделение ее от перфорированной поверхности кювет и последующую обработку. Растильные камеры работают по следующему режиму: загрузка - 2 ч, культивирование гриба - 22–30 ч, подсушка культуры - 3–6 ч, разгрузка - 2 ч, уборка и мойка камеры - 1 ч, обработка формалином, аммиаком (для удаления формалина) и паром - 3 ч, аэрирование - 3 ч.

Поверхностный метод отличается большими затратами ручного труда, малой производительностью растильных камер, потребностью в больших производственных площадях. Преимущество метода - высокое содержание фермента в массе поверхностной культуры.

В современных условиях поверхностное культивирование грибов осуществляют в механизированных установках, среди которых наибольший интерес представляет колонный аппарат с жалюзийными тарелками, на которых грибы выращивают в слое сыпучей среды толщиной до 300 мм.

Глубинное культивирование продуцентов ферментов имеет ряд преимуществ перед поверхностным: позволяет значительно сократить производственные площади, исключает непроизводительный ручной труд, улучшает гигиену труда, позволяет автоматизировать производство. При глубинном культивировании улучшается степень использования компонентов питательной среды, сокращается объем отходов производства, облегчается получение очищенных препаратов ферментов.

Ферментацию осуществляют в строго асептических условиях. Основными компонентами питательных сред при глубинном культивировании продуцентов ферментов являются картофельный и кукурузный крахмал, кукурузная мука, кукурузный экстракт, макро- и микроэлементы. Одним из важнейших микроэлементов, стимулирующих образование протеиназ мицелиальными грибами, является цинк. При глубинном культивировании более отчетливо проявляется индуцибельность синтеза ферментов. Большинство ферментов являются экстрацеллюларными продуктами и выделяются в окружающую жидкую среду. В мицелии остается, как правило, не более 10–15% от всех ферментов.

Оптимальное значение рН среды для биосинтеза ферментов зависит от особенностей продуцента, но имеются и общие закономерности. Грибы и дрожжи хорошо растут и образуют ферменты при рН среды 3,8–5,6, бактерии лучше всего развиваются при рН, близком к нейтральному (6,2–7,4). В зависимости от состава среды и продуктов метаболизма рН среды при ферментации может понижаться или повышаться. Уровень и скорость образования ферментов зависит от интенсивности аэрации ферментационной среды. В целом увеличение степени аэрирования среды приводит, как правило, к интенсификации биосинтеза ферментов и сокращению длительности культивирования.

Поверхностная культура содержит большое количество балластных веществ, поэтому из глубинных культур легче получить очищенные препараты ферментов. Но в этом случае выделять ферменты приходится из очень разбавленных растворов. Доля собственно ферментов составляет около 1% в поверхностных и не более 0,1% в глубинных культурах. На рис. 8.1 представлена принципиальная схема выделения и очистки ферментов из поверхностной и глубинной культур. В некоторых отраслях возможно использование неочищенных препаратов ферментов. Поверхностная культура нестабильна при хранении из-за повышенной влажности. Ее измельчают в дробилках до частиц размером 5−6 мм и высушивают в барабанных или конвейерных сушилках до влажности 10–12% при температуре теплоносителя 80–85°С. При этом материал не должен разогреваться до температуры более 40–42°С. Глубинная культура может быть использована в виде культуральной жидкости, освобожденной или неосвобожденной от взвешенных веществ. Такие простейшие препараты имеют марку Пх и Гх соответственно.

Очищенные ферментные препараты получают из экстракта поверхностной культуры и фильтрата культуральной жидкости. Ферменты являются водорастворимыми белками и экстрагируются водой. Для извлечения ферментов из дрожжей или бактерий необходимо предварительное разрушение клеточных стенок. Диффузионное сопротивление оболочек мицелия намного меньше, и дезинтеграция культур грибов не требуется.

Экстракцию ферментов из сухой и измельченной поверхностной культуры проводят в диффузионной батарее из 8–10 аппаратов объемом по 300 л или в экстракторах непрерывного действия. Применяемая в качестве экстрагента вода содержит антисептик и имеет температуру 25–28°С. В большинстве случаев ферменты наиболее полно извлекаются при рН 5–7. Экстракцию проводят в режиме противотока с расходом воды 200–400% по отношению к массе культуры. Экстракт содержит 10–14% сухих веществ.

Экстракт из поверхностной культуры грибов и фильтрат глубинной культуры нестабильны при хранении. Для получения товарных форм ферментных препаратов их необходимо сконцентрировать.

Рис. 6. Принципиальная схема получения технических и очищенных

ферментных препаратов из культур микроорганизмов

Ферменты очень чувствительны к термической обработке и нуждаются в мягких режимах концентрирования. Известно, что присутствие примесей в растворе повышает термическую устойчивость фермента. Чем чище перерабатываемый раствор фермента, тем больше его потери в результате термической инактивации. В производственных условиях концентрирование растворов чаще всего осуществляют упариванием при глубоком вакууме (температура кипения раствора до 30°С). Но избежать значительных потерь активности не удается.

Наиболее перспективный метод концентрирования ферментных растворов - ультрафильтрация, которую проводят при комнатной температуре, с малыми энергетическими затратами и при отсутствии тепловой инактивации фермента. Рабочим элементом ультрафильтрационной установки является полупроницаемая мембрана, которая обладает высокой селективностью и обеспечивает разделение низко- и высокомолекулярных соединений с получением концентрата высокомолекулярных соединений (ферментов). Таким образом, ультрафильтрация позволяет сконцентрировать ферментный раствор и одновременно очистить его.

Кроме селективности, мембраны должны обладать высокой пропускной способностью, механической прочностью, химической и биологической инертностью, стабильностью пористой структуры. Наиболее высокопроизводительны и компактны установки с элементами из полых волокон диаметром 50–250 мкм и толщиной стенки 15–100 мкм. Фильтрующая поверхность таких установок достигает 20 000 м²/м³ (производитель фирма «Дюпон», США). Метод ультрафильтрации перспективен как на стадии концентрирования ферментных растворов, так и как способ очистки ферментов.

В производстве очищенных ферментных препаратов широко применяется метод осаждения ферментов из растворов органическими растворителями или (реже) высококонцентрированными растворами солей (высаливание). Эффект осаждения белков связан с тем, что органические растворители и ионы солей разрушают гидратную оболочку молекулы белка. При этом растворимость белков падает, происходит агрегирование и осаждение белковых молекул. Агрегирование белков осуществляется за счет электростатических и Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий между белковыми молекулами.

В производстве для осаждения ферментов используют этанол, ацетон, изопропанол. Наиболее эффективен изопропанол. Белки осаждаются при сравнительно низкой концентрации изопропанола (52–53%), а препараты содержат меньше балластных веществ. Последовательным увеличением концентрации растворителя в растворе можно осуществить фракционирование ферментного комплекса. Например, при концентрации этанола 48–52% осаждается протеаза из раствора комплекса ферментов Aspergillus oryzae. После отделения осадка протеазы концентрацию этанола повышают до 70–74%, и в осадок выпадает амилаза.

При смешивании растворителя и водного раствора фермента выделяется тепло, и температура смеси повышается на 5–10°С. При температуре смеси 10–15°С наблюдается инактивация фермента. Причем имеет место не только термоинактивация. Повышение температуры в присутствии растворителя приводит к нарушению структуры фермента и часто к изменению конформации активного центра с потерей ферментом каталитической активности. В связи с этим длительность контакта фермента с растворителем должна быть сведена до минимума. Оптимальная температура осаждения, равная 3–5°С, достигается охлаждением раствора фермента до 1–3°С, а растворителя - до температуры от -8 до -10°С. Наиболее полно ферменты осаждаются при величине рН, близкой к изоэлектрической точке. Отклонение величины рН от данной точки снижает выход осадка и активность фермента.

Для высаливания ферментов часто используют сульфат аммония, реже хлорид натрия, сульфат цинка и другие соли. Осаждение проводят раствором с концентрацией соли 0,5-0,9 от полного насыщения. Осажденные ферментные препараты содержат 20–80% соли от массы осадка, что не всегда удовлетворяет потребителя. В отличие от растворителей, которые легко регенерируют ректификацией, регенерация соли представляет сложную задачу. Положительным фактором является то, что осадки, полученные при высаливании, содержат меньше балластных веществ и лучше растворяются в воде, что важно для их дальнейшей обработки.

Белки могут агрегироваться без денатурации в присутствии высокомолекулярных нейтральных водорастворимых полимеров. Например, в промышленных условиях используют полиэтилен-гликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 и 20 000 Да, декстраны. Для осаждения ферментов требуются низкие концентрации ПЭГ в смеси - 6-12%.

В лабораторной практике при получении высокоочищенных ферментов применяют ряд других методов, перспективных для промышленного использования: ионообменную хроматографию, аффинную адсорбционную хроматографию, хроматографию на окрашенных адсорбентах (фермент проявляет сродство к красителю) и некоторые другие. Весьма эффективен для разделения и очистки ферментов в производственных условиях метод гель-фильтрации.

Завершает стадии выделения и очистки процесс сушки ферментных препаратов. Жидкие полупродукты сушат в распылительных сушилках в мягких условиях: температура теплоносителя на входе в сушилку не должна превышать 130°С, на выходе - 50–70°С. Снижает потери ферментативной активности при сушке введение в жидкий полупродукт наполнителя (например, NaCl). Влажные осадки высушивают в вакуумных сушильных камерах или в барабанных вакуум-сушилках, обогреваемых водой с температурой 50–60°С. Продолжительность сушки в этих аппаратах 10–14 ч.

В качестве примера рассмотрим отечественную технологию производства глюкаваморина Г2х.

Продуцентом амилаз является гриб Aspergillus awamori ВУДТ-2, который размножают на среде Чапека с сахарозой или крахмалом (2–3%). Глюкоамилазная активность культуры не менее 180 ед./см³. Конидиальный посевной материал получают на твердой питательной среде (пшеничные отруби и солодовые ростки в соотношении 1 : 1 по массе) в колбах на 750 см³ (30–40 г среды). После засева культурой из пробирок со средой Чапека колбы термостатируют 5–6 суток при температуре 30°С, а затем выдерживают при комнатной температуре 7–8 суток (до обильного конидиеобразования). Поученным конидиальным материалом в виде водной суспензии засевают посевной аппарат из расчета 10–15 г культуры на 1 м³ питательной среды, имеющей следующий состав (в %): кукурузная мука – 5,0; кукурузный экстракт – 1,0. Величина рН исходной среды 4,8–5,0. В смесителе готовят водно-мучную суспензию, добавляют кукурузный экстракт, подогревают до 57–80°С и подают в посевной аппарат, в котором питательную среду стерилизуют при 125–130°С в течение 1,5 ч. Охлажденную до 28–30°С питательную среду засевают культурой из колб. Продолжительность накопления биомассы гриба в посевном аппарате 20–24 ч.

Производственная среда содержит (в кг/м³): кукурузную муку – 300; ячменный солод для разжижения мучного замеса – 1,5; гидрофосфат аммония – 4,5; ячменный солод для осахаривания крахмала – 7,5. Величина рН среды 3,5–4,8. Технологическая схема приготовления питательной среды представлена на рис. 8.2.

Кукурузная мука смешивается в шнековом смесителе с водой (температура 40°С) в соотношении 1 : 3. Водно-мучная суспензия в емкостном смесителе обогащается гидрофосфатом аммония и разжижается ячменным солодом при перемешивании в течение 20–30 мин с повышением температуры до 60°С. Полученная масса разваривается при 130°С с выдержкой 15 мин (нагревательная колонка + выдерживатель). Разваренная масса охлаждается в теплообменнике типа «труба в трубе» до 60°С и подвергается осахариванию ячменным солодом в течение 10–15 мин. Осахаренная масса направляется на стерилизацию (нагревательная колонка + выдерживатель) при температуре 120–123°С в течение 15 мин и после охлаждения поступает в ферментатор.

Рис. 8.2. Приготовление и стерилизация питательной среды: 1 – шнековый

смеситель; 2 – емкостной смеситель; 3 – фильтр сетчатый; 4 – нагревательная

колонка; 5 – выдерживатель; 6 – холодильник; 7 – осахариватель

Производственную ферментацию осуществляют в условиях асептики при температуре 32°С в течение 5–6 сут. Расход воздуха на аэрацию среды в ферментаторе 50 м³/(м³·ч). Культуральную жидкость хранят в сборниках в захоложенном состоянии (12–15°С) без существенных потерь активности до 200 ч. КЖ может быть реализована как ферментный препарат глюкаваморин Гх. Для получения препарата с индексом Г2х отделяют биомассу гриба фильтрованием на фильтре-прессе ФПАКМ, фильтрат концентрируют с одновременной очисткой от низкомолекулярных примесей на ультрафильтрационной установке с получением жидкого концентрата амилаз (активность 800–1000 ед./дм³). Продукт стабилизируют введением консерванта (например, бензойнокислого натрия).