РЕАКЦИИ ИММУНИТЕТА

Реакциями иммунитета (серологическими реакциями) называют действие между анти­генами и антителами, ведущее к образованию иммунного комплекса (антиген-антитело). Они про­текают, как правило, в 2 фазы в присутствии дополнительного фактора (электролит, комплемент, фагоцит или др.). Специфическая фаза (невидимая, "химическая") происходит очень быстро и ха­рактеризуется соединением детерминантной группы антигена с активным центром антитела, В ре­зультате образуется комплекс, утрачивающий растворимость в изотонических растворах например, в растворе хлорида натрия. Неспецифическая фаза (видимая, "коллоидная") наступает через не­сколько минут или часов и характеризуется укрупнением комплекса антиген+антитело с изменением его физических свойств. Эта фаза сопровождается видимыми феноменами: выпадением осад­ка, образованием хлопьев, просветлением взвеси, остановкой движения частиц и др.

Реакции иммунитета высокоспецифичны и их широко применяют на практике для серодиаг­ностики инфекций (по обнаружению антимикробных антител в сыворотке крови), определения ви­да и варианта микроба по антигенной структуре, определения других антигенов (аллергенов, гор­монов, биологических образцов разного происхождения). Области применения реакций иммунитета: диагностика инфекционных и неинфекционных заболеваний, фармация, санитарно-ветеринарная служба, трансплантация органов и тканей (в т.ч. крови), судебная медицина.

Реакция агглютинации(РА) - это взаимодействие корпускулярного антигена (взвеси бакте­рий, других клеток или частиц) и антител - агглютинов в изотоническом растворе с образованием и осаждением агглютината (хлопьев из склеившихся частиц).

Реакцию ставят несколькими методами. Быстрая ориентировочная РА ставится на предмет­ном стекле и учитывается в течение 2-3 мин после смешивания ингредиентов и покачивания стек­ла. Более надежные результаты даёт использование адсорбированных и монорецепторных сыворо­ток, что позволяет избежать неспецифических реакций, например, с родственными бактериями за счет общих антигенов. Развернутая (объёмная) РА более точна, она ставится в пробирках и учиты­вается через сутки. В ряду пробирок готовят последовательные двукратные разведения сыворотки в ИХН - 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 и т.д. Затем в каждую пробирку добавляют одинаковое количест­во взвеси клеток, встряхивают и ставят при комнатной температуре. Результат учитывают по ха­рактеру осадка и просветлению надосадочной жидкости. Титром агглютинирующей сыворотки считают её максимальнее разведение, при котором наблюдается выраженная реакция. РА используют для идентификации микробов по антигенной структуре, для определения антимикроб­ных антител и их титра в сыворотке при серодиагностике инфекционных заболеваний, при опреде­лении группы крови и т.п.

Реакция пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА) является разновидностью не­прямых агглютинационных реакций, наряду с реакцией коагглютинации, агглютинации латекса и др. Эти реакции более чувствительны, чем РА, т.к. предварительно стандартный антиген (или ан­титело) присоединяют к корпускулярному носителю - эритроцитам, убитым микробам или части­цам латекса, получая, соответственно, эритроцитарные, коагглютинирующие или латексные диагносгикумы (антигенные или иммуноглобулиновые). РПГА с антигенным эритроцитарным диагностгкумом ставят в пробирках или лунках планшета с двукратными разведениями сыворотки (например, с целью серодиагностики инфекций или выявления напряжённости иммунитета - по титру антител). При положительной реакции через 4-20 ч формируется рыхлый осадок эритроци­тов на всей площади дна пробирки или лунки - «зонтик». При отрицательной реакции эритроциты образуют плотный осадок в центре (в виде «пуговки»). РПГА с иммуноглобулиновыми диагности-кумами учитывают так же, но её ставят для быстрой индикаций возбудителя в исследуемом мате­риале или его идентификации по антигенной структуре. Это метод экспресс-диагностики.

Реакция преципитации (РП) - это выпадение в осадок растворимого антигена при взаимо­действии с сответствующими антителами-преципитинами в присутствии электролита. Антигеном может быть прозрачный раствор белка или гаптена, различные экстракты.

РП ставят несколькими методами. Метод кольцепреципитации: на диагностическую сыворот­ку с известными преципитинами в узкой пробирке сверху осторожно наслаивают раствор антигена и в течение часа учитывают положительную реакцию (на границе жидкостей образуется белый диск преципитата и постепенно оседает). Так определяют, например, антиген возбудителя сибир­ской язвы в разных материалах. Метод преципитации в капилляре: стеклянный капилляр диамет­ром I мм сначала опускают на 1/3 в диагностическую сыворотку, а затем на 1/3 - в раствор антиге­на, переворачивают несколько раз и оставляют в вертикальном положении на сутки. Зёрна преципитата оседают и собираются столбиками на нижнем мениске жидкости в капилляре. Так оп­ределяют, например, С-реактивный белок (СРБ) при аутоиммунных заболеваниях, ревматизме, ту­беркулёзе, инфаркте миокарда (диагностическую сыворотку с преципитинами к СРВ получают пу­тем иммунизации кроликов). Методы диффузной преципитации в агаровом геле: растворы антигенов и антител помещают в разные места прозрачного геля, из которых они диффундируют, образуя при встрече преципитат в виде белых полос или линий. В методе простой диффузии анти­ген диффундирует в агаре, содержащем определенную концентрацию диагностической сыворотки, которую предварительно вводили в не застывший агар. В методе двойной диффузии антигены и антитела из лунок в агаре диффундируют навстречу друг другу в нейтральном слое агара.

В методе иммуноэлектрофореза раствор неоднородного антигена сначала подвергают фрак­ционированию в агаровом геле под действием постоянного тока а затем канавку в теле, сделанную сбоку от линии распределения фракций заполняют сывороткой (антителами). В результате двой­ной диффузии в геле образуется специфический рисунок из дуг к линий преципитата, вид которого зависит от количества и качества фракций антигена и антител.

РП обладает высокой чувствительностью, она позволяет выявлять белковые антигены в раз­ведениях 1:100000 и выше, т.е. недоступных для обнаружения химическим путём. Титром преципитирующей сыворотки считают наибольшее разведение антигена, дающее преципитацию при контакте с ней. Такая особенность связана с мелкодисперсным состоянием антигена, малы­ми размерами его молекул. РП применяют для индикации микробных антигенов в материале от больных и из внешней среды, определения иммуноглобулинов разных классов (диагностика и профилактика инфекций и иммунодефицитов) для выявления фальсификации пищевых продуктов (санитарная практика), для определения видовой принадлежности крови и других биологических примесей (судебно-медицинская практика).

Реакция нейтрализации токсина антитоксином(РН) - серологическая реакция между мик­робным экзотоксином и антителами, приводящая к инактивации ядовитого действия токсина. Её ставят в опытах на животных: для обнаружения экзотоксина в исследуемом материале; для опре­деления титра антитоксина в иммунной сыворотке. Например, материал, содержащий экзотоксин, смешивают с известной диагностической сывороткой (в избытке), выдерживают 30 мин и вводят животным. Если сыворотка нейтрализует токсин, отравления и гибели животных нет. Если токсин не соответствует антитоксинам сыворотки, животные погибают (как и в контрольной группе жи­вотных, получивших тот же материал без сыворотки). В обычной лабораторной практике данную реакцию используют для диагностики ботулизма. Для определения антитоксической сыворотки ставят такой же опыт, но берут стандартный экзотоксин известной, силы и смешивают с сыворот­кой в разных соотношениях. Определяют наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее оп­ределенное число минимальных летальных доз-DLM токсина (это количество соответствует I ан­титоксической единице, АЕ сыворотки). Титр сыворотки выражают количеством АЕ или ME (международных антитоксических единиц) в I мл сыворотки. Например, I ME противодифтерий­ной сыворотки нейтрализует 100 DLM дифтерийного токсина для морской свинки.

Титрование антитоксических сывороток проводят и в пробирках - в реакции флоккуляции (разновидность РП). Оно основано на том, что при смешивании экзотоксина или анатоксина (т.е. белкового антигена) с титруемой сывороткой наиболее раннее помутнение (инициальная флокку-ляция) наблюдается в пробирке с эквивалентным соотношением токсина (анатоксина) и антиток­сина (т.е. I TE (Lf) : I АЕ (МЕ)).

Реакция иммунофлюоресценции(ИФ) - взаимодействие люминесцирующих антител с кор­пускулярным антигеном и образование светящегося иммунного комплекса. Метод основан на спо­собности иммуноглобулинов прочно соединяться с флюорохромами (ФИТЦ, акридиновым оран­жевым и др.) без потери специфичности. Под действием ультрафиолета флюорохромы дают вторичную люминесценцию.

В прямом методе ИФ на предметном стекле готовят и фиксируют мазок из антигенсодержащего материала, наносят на него люминесцирующую сыворотку (например, противочумные анти­тела, меченные ФИТЦ). После 30-минутного контакта препарат тщательно промывают и изучают под люминесцентным микроскопом. Клетки чумного микроба в исследуемом материале светятся по периферии желто-зеленым цветом. ИФ протекает в I фазу и обладает рядом достоинств: высо­кочувствительна, проста в постановке, может использоваться как метод экспресс-диагностики (ответ в течение 1-2 ч). Её используют для быстрого обнаружения микробов в исследуемом материа­ле, а также для их идентификации.

Непрямой метод ИФ отличается тем, что на стекло наносят обычные кроличьи антитела, ко­торые образуют с клетками невидимый комплекс АГ+АТ. Затем препарат промывают и обрабаты­вают люминесцирующей: сывороткой с ослиными (лошадиными) AT к кроличьему белку (образу­ется двойной светящийся комплекс). Этот метод более экономичен, т.к. используется одна люминесцирующая и набор нелюминесцирующих сывороток.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Основан на использовании антител, меченных фермен­том, который проявляет в присутствии субстрата специфическую активность в случае образования комплекса антиген+антитело, фиксированного на твёрдой основе. ИФА широко используют для определения разнообразных антигенов и антител. Разработано много методов и модификаций ИФА, выпускаются коммерческие наборы. Для определения антигена в исследуемом материале (сэндвич-метод) вначале производят сорбцию известных антител на поверхности лунок полистиро­ловой пластины, затем вносят антигенсодержащий материал, и, после контакта, тщательно промывают. Затем в лунки добавляют соответствующие антитела (сыворотку), меченные пероксидазой хрена или другим ферментом, отмывают и добавляют хромогенный субстрат (5-аминосалициловую кислоту с перекисью водорода или др.).

При положительной реакции в течение 1 часа развивается коричневое окрашивание, интен­сивность которого зависит от количества меченных антител, связанных в иммунном комплексе. Для определения неизвестных антител (например, с целью серодиагностики сифилиса или ВИЧ-инфекции) на поверхности лунок сорбируют известный антиген, затем добавляют исследуемую сыворотку крови, промывают, вносят сыворотку с антителами против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом,и, после вторичной промывки, добавляет хромогенный субстрат. Учиты­вают так же. ИФА отличается высокой чувствительностью и специфичностью.