Рестриктазы 4 страница

К веществам, загрязняющим водоемы и почву относят:

различные яды и вредные вещества — соли тяжелых металлов, мышьяк, цианиды, фенолы, анилин, пестициды и др., ингибирующие активность ферментных систем, связывающие кислород или нарушающие жизненные процессы;

кислоты и щелочи, изменяющие реакцию среды в природных водоемах и приводящие к нарушению равновесия в живых системах;

поверхностно-активные вещества, которые в последнее время с развитием химической промышленности все чаще попадают в природные водоемы, образуя слой пены на поверхности.

Эти вещества очень опасны, так как часто недоступны воздействию микроорганизмов и не разрушаются;

4) растворимые органические вещества, содержащие углерод, азот, нефтепродукты, углеводы и т. д.

Данная группа веществ используется микроорганизмами в качестве субстрата и способствует их чрезмерному размножению в водоемах. В свою очередь, это приводит к увеличению расхода растворенного в воде кислорода и развитию анаэробной, гнилостной микрофлоры, что вызывает вымирание других форм жизни. В таких условиях могут развиваться микроорганизмы, опасные для здоровья человека, например сульфатредуцирующие бактерии, в результате действия которых появляется неприятный запах сероводорода и т.д.;

5) нерастворимые органические соединения — крахмал, целлюлоза, лигнин, другие высокомолекулярные вещества, которые в виде плавающих частиц поступают в водоемы и вызывают последствия, схожие с действием веществ предыдущей группы;

6) радиоактивные и другие вредные загрязнители.

Водоемы и почва представляют собой биологические системы, способные утилизировать отходы. В почву помимо отходов сельского хозяйства (навоз, солома и др.) попадают коммунальные и промышленные отходы. Как известно, навоз, компосты и солома являются удобрениями для полей. Однако необходимо знать предельные количества внесения удобрений. Вокруг крупных животноводческих комплексов требуются большие земельные площади, чтобы без ущерба для почвы утилизировать образующийся навоз. Жидкий свиной навоз перед вывозом на поле необходимо выдержать 6—8 мес., чтобы инактивировать патогенную микрофлору. При использовании отходов животноводческих ферм для удобрения полей, один из критериев — содержание азота, максимально допустимая доза которого составляет 300 кг/га. Практика показывает, что количество жидких отходов свиноферм, вносимых методом орошения за 1 год на площадь 1 га, не должен превышать 250 м³. Но на больших животноводческих комплексах ежесуточно образуются сотни тонн жидких отходов, следовательно, под них требуется сотни гектаров земель. На полях можно утилизировать также отходы пищевой промышленности, ил очистных сооружений. Допустимое количество отходов зависит от свойств почвы, химического и биологического состава отходов.

Аэробные системы очистки стоков

В стоках, загрязненных органическими веществами, в присутствии кислорода интенсивно развивается аэробная микрофлора. Возникают очень сложные ассоциации, образующие так называемый активный ил, куда входят различные бактерии и простейшие, находящиеся в сложных трофических взаимоотношениях. При интенсивной аэрации среды и сбалансированных соотношениях биогенных элементов основную массу ила образуют бактерии. При этом очень важно обеспечить седиментационные свойства ила, т. е. образование флокул, которые задерживались бы в аэротенке и оседали при выходе из него. Это технологически облегчает возвращение флокул в аэротенк, а также осаждение в отстойниках. Флокулы ила имеют размеры до 150 мкм и различную форму.

На практике можно считать, что из общей массы утилизированных органических веществ образуется 50 % микробной биомассы, т. е. половина органических веществ перегазируется в СО₂. Чтобы превратить в газообразные соединения активный ил, образовавшийся при аэробной очистке стоков, обычно в систему очистных сооружений включают стадию анаэробного метанового сбраживания. При этом 95 % СВ ила превращается в биогаз.

На практике для очистки стоков используют различные технические системы. Если сточные воды не сильно загрязнены, для очистки можно использовать окисление на капельных или биологических фильтрах. При этом предварительно очищенную от механических примесей и жиров жидкость пропускают через плотный слой каменной щебенки, кокса или крупнозернистого (0,5—5 см) полимерного материала (полистирола или полипро­пилена) толщиной 0,9 — 3 м. Через несколько недель поверхность слоя покрывается слизистой пленкой, состоящей из микробной массы. В контакте с воздухом (в случае необходимости используют принудительную циркуляцию воздуха) микроорганизмы начинают эффективно окислять органические вещества сточных вод. БПКз их равен 500 мг/л. Пропуская через биологические фильтры промышленные сточные воды со скоростью 1000— 1200 л/м³ в сутки, добиваются снижения БПКб до 10 мг/л. Воздух можно пропускать снизу вверх и наоборот. Подача воздуха должна быть около 0,6 м³/мин на 1 м² поверхности фильтра.

При работе с биологическим фильтром надо следить за составом сточных вод, не допускать перегрузку фильтра и предотвращать уничтожение микрофлоры токсичными соединениями и нерастворимым остатком. В холодное время года такие системы очистки снижают или совсем теряют свою эффективность, так как невозможно регулировать температуру воды.

На сезонных предприятиях, например на сахарных заводах, для аэробной очистки вод используют биологические пруды - систему прудов глубиной 0,6—1,2 м. Одновременно они служат водохранилищами. В прудах нельзя допускать протекания анаэробных процессов гниения. В теплое солнечное время в прудах могут развиваться одноклеточные фотосинтезирующие водоросли, весьма благоприятно влияющие на очистку воды. По окончании сезона работ воду спускают, а ил используют в качестве удобрения.

Способы очистки сточных вод базируются на микрофлоре, способной активно перерабатывать загрязнения. Для деятельности микроорганизмов кроме органических питательных веществ необходим кислород и в небольшом количестве биогенные вещества в виде азот- и фосфорсодержащих веществ.

В биологических фильтрах бактерии находятся в неподвижном состоянии в слизистой пленке, покрывающей крупнозернистую поверхность наполнителя. Очищаемая вода медленно капает сверху, а в щели между гранулами поступает воздух естественным путем или принудительно (аэрация). Мощность биологических фильтров зависит от площади поверхности наполнителя.

В биологических прудах колонии микроорганизмов свободно перемещаются в воде. Кислород поступает через водную поверхность или от фотосинтезирующих водорослей и естественным образом медленно растворяется в воде. Микроорганизмы свободно перемещаются в воде. Кислород поступает через водную поверхность или от фотосинтезирующих водорослей и естественным образом медленно растворяется в воде. Концентрация микроорганизмов и одноклеточных растений должна быть не слишком высока, иначе на дне прудов появится дополнительный слой осадка, анаэробные процессы гниения начнут преобладать над аэробными, и произойдет вторичное загрязнение воды.

На промышленных предприятиях, в том числе относящихся к микробиологической промышленности, в состав очистных сооружений обычно входят следующие узлы: усреднитель стоков для выравнивания концентраций загрязнений и стабилизации потока сточных вод; отстойник для осаждения взвешенных веществ; аэротенк или биофильтр, в котором осуществляется собственно биодеградация органических соединений; регенератор, в котором осуществляется восстановление активности ила; отстойник активного ила.

Таким образом, современные аэротенки фактически являются ферментаторами различной мощности, в которых выращивается активный ил. Как правило, в аэротенках реализуется только непрерывный процесс, чаще всего с рециркуляцией активного ила.

Анаэробные системы очистки стоков

Для очистки сточных вод в народном хозяйстве при утилизации отходов животноводческих ферм, производстве кормового витамина B₁₂ и в других случаях используют метановое брожение. Этот процесс широко распространен в природе (разложение органических веществ в болотах, водоемах, в почве, у животных в рубце и т.д.). Метановое брожение - строго анаэробный процесс, осуществляется, как правило, в особых аппаратах — метантенках.

Биодеградация органических веществ при метановом брожении в метантенках протекает в три последовательные фазы.

В первой, гидролитической фазе около 76 % органических веществ переходит в высшие жирные кислоты, до 20 % - в ацетат и 4 % - в водород. Первую фазу можно разбить, в свою очередь, на фазы гидролиза и ацидогенеза (кислотообразования). Во второй фазе главными являются процессы образования из высших жирных кислот ацетата (52 %) и водорода (24%). В третьей фазе (брожение) метаногенные бактерии образуют из ацетата 72 % метана, и СО₂ — 28 % метана. Соотношение промежуточных и конечных продуктов в процессе метанового брожения зависит от состава среды, условий ферментации и присутствующей микрофлоры.

Плазми́ды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы, но изредка плазмиды встречаются также у архей и эукариот.

В природе плазмиды обычно содержат гены, повышающие устойчивость бактерии к неблагоприятным внешним факторам (в т. ч. устойчивость к антибиотикам), нередко они могут передаваться от одной бактерии к другой (иногда даже к бактерии другого вида) и, таким образом, служат средством горизонтального переноса генов.

Попадание плазмиды в клетку может осуществляться двумя путями: либо при непосредственном контакте клетки-хозяина с другой клеткой в процессе конъюгации, либо путём трансформации, то есть искусственное введение в клетку плазмиды, которому предшествует изменение экспрессии определённого гена клетки-хозяина (приобретение клеткой компетентности).

Искусственные плазмиды используются как векторы в клонировании ДНК, причём благодаря их способности к репликации обеспечивается возможность репликации рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине.

Многие плазмиды не вызывают заметных изменений в фенотипе своих хозяев. Другие, напротив, ответственны за проявление у клетки-хозяина свойств, помогающих ей выжить в определённых условиях окружающей среды, и без этих плазмид бактерии погибали бы или их рост замедлялся. В экологической биотехнологии применяют микроорганизмы, несущие плазмиды с генами биодеградации ксенобиотиков.

1. Аэробная и анаэробная системы очистки стоков. Активный ил. Современные установки для очистки и обеззараживания сточных вод с применением микроорганизмов и ферментов.

Биологическая очистка предполагает деградацию органической составляющей сточных вод микроорганизмами (бактериями и простейшими).

На данном этапе происходит минерализация сточных вод, удаление органического азота и фосфора, главной целью является снижение БПК.

Могут использоваться как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы.

С технической точки зрения различают несколько вариантов биологической очистки. На данный момент основными являются активный ил (аэротенки), биофильтры и метантенки (анаэробное брожение).

Первичные отстойники, куда на этом этапе попадает вода, предназначены для осаждения взвешенной органики. Это железобетонные резервуары глубиной пять метров и диаметром 40 и 54 метра. В их центры снизу подаются стоки, осадок собирается в центральный приямок проходящими по всей плоскости дна скребками, а специальный поплавок сверху сгоняет все более легкие, чем вода, загрязнения в бункер.

Также в биологической очистке, после первичных отстойников и аэротенков существует вторая линия радиальных отстойников. Во вторичных отстойниках находятся илососы. Они предназначены для удаления активного ила со дна вторичных отстойников очистных сооружений промышленных и хозяйственных стоков.

Активный ил аэробных очистных систем

Микрофлору биологических очистных систем составляют микроорганизмы, являющиеся биохимическим агентом при аэробной очистке сточных вод, образуют сложные сообщества активного ила и биопленки. Такие сообщества микроорганизмов (называемые также смешанной культурой, смешанным биоценозом) состоят из представителей многих систематических групп — бактерий, актиномицетов, грибов, водорослей, членистоногих. Основу биомассы таких сообществ составляют бактерии. Общая поверхность 1 грамма сухой биомассы этих микроорганизмов оценивается площадью около 100 м2, что и обусловливает высокую скорость обменных процессов при очистке сточных вод.

Биопленка, покрывающая твердые поверхности, погруженные в объем жидкости аэробных биохимических реакторов, образована иммобилизованными клетками микроорганизмов, ее толщина обыч­но не более 3 мм, чаще 0,5 - 1,0 мм.

Состав микроорганизмов активного ила и биопленки подвержен изменениям в широких пределах и зависит от условий культивирования, температуры в реакторе. Отмечается влияние мутагенных факторов сточной воды на состав микрофлоры очистных сооружений.

Бактериальный состав активного ила сточных вод в значительной мере зависит от состава очищаемой сточной воды. Наиболее многочисленным родом в микрофлоре аэробных очистных систем является Pseudomonas - грамотрицательные палочковидные бактерии. Распространенность представителей этого рода бактерий обусловлена широким спектром компонентов загрязнений, которые могут служить для них субстратом.

У бактерий рода Pseudomonas имеется около 150 ферментных систем, способных превращать вещества сточной воды в биомассу и обеспечивать клетку энергией. К порядку Pseudomonas относится 50 – 80 % биомассы бактерий илов аэробных систем очистки производственных сточных вод. В этот порядок входят бактерии, окисляющие нитриты (Nitrosomonas), соединения серы (Sulfomonas, Thiobacillus).

В производственных стоках встречаются многие виды Bacterium. К ним относится аммонификаторы В. Micoides, разлагающие органические аминосодержащие соединения (белки, мочевину, аминокислоты) с образованием иона NH4+ или свободного аммиака.

Бактериальный состав активных илов стабилен в течение длительного периода эксплуатации. Доминирующими родами являются Pseudomonas и Alcaligenes (5-39 и 36-84% соответственно), в то время как Bacillus, Zoogloea и факультативные анаэробы являются индикаторами нарушения процесса очистки. При перегрузке очистной системы резко возрастает содержание Zoogloea — до 45 %.

Прослеживается также изменение количества простейших от нагрузки на активный ил. В активном иле имеются так называемые индикаторные организмы, по состоянию которых судят о нормальном протекании процессов очистки. К ним относятся инфузории – Ciliata, Paramecium, Lacrimaria, Stentor, Stilonichia, Euplofes patella, Aspidisca costata, Opercularia, Vorticella. Установлено, что в нормально развитом биоценозе на 1016 клеток бактерий приходится 10-16 клеток простейших, в илах худшего качества -- 5-9 клеток, а в илах ненормально работающих очистных систем — 1-4 клетки. Из других организмов в илах встречаются коловратки (Rotatoria), являющиеся индикатором нормального насыщения жидкости кислородом.

В системах с изменяющейся нагрузкой на активный ил по ходу движения жидкости (аэротенки-вытеснители, биофильтры) изменяется состав микрофлоры. На начальной стадии процесса очистки, когда на единицу биомассы приходится большая часть субстрата, в биоценозе преимущественно развиваются гетеротрофные бактерии и простейшие, питающиеся растворенными компонентами сточной воды. Далее со снижением загрязненности воды уменьшается количество бактерий, появляется больше свободноплавающих простейших, питающихся бактериями. В конце процесса очистки развивается большое количество хищных простейших, появляются низшие беспозвоночные.

В биопленке, покрывающей поверхности носителя в реакторах с иммобилизованной микрофлорой, помимо бактерий наблюдается большое количество простейших, коловраток, червей. Биоценоз ила аэротенков и биопленка идентичны при очистке одной и той же воды, однако количество различных видов организмов разное. Показателем хорошего состояния биопленки является наличие инфузорий кругловых, брюхореспичных, жгутиковых, червей Nematoda, коловраток.

На стадии окончания биологической очистки воды протекают процессы нитрификация с образованием нитритов и жиратов. В этом процессе в качестве биологических агентов выступают бактерии из родов, Nitrosomonas и Nitrobacter. Наиболее изученным микроорганизмом, осушествляющим окисление аммонийного азота до нитритов — нитрификацию первой фазы, является Nitrosomonas europaea. Основной биологический агент нюрой фазы нитрификации — окисления нитритов в нитраты — Nitrobacter Vinogradskyi.

Глубокая биологическая доочистка сточных вод осуществляется с помощью культуры микроводорослей.

При создании благоприятных условий для культивирования микроволорослей (освещенность, температура, субстрат) их смешанное сообщество обычно состоит из представителей род jd Chlorella, Scenedesmus, Nitzschia, Ankistrodesmus.

При достаточном количестве органического субстрата в сточной Воде в освещенном культиваторе наблюдается симбиоптическое взаимодействие между сообществами бактерий и микроводорослей. Культура микроводорослей спонтанно развивается в условиях достаточной освещенности на последних стадиях очистки воды в дисковых биофильтрах, биопрудах.

Положительный эффект от культивировании микроводорослей заключается не только в снижении концентрации азота и фосфора в очищенной воде, а в их обеззараживающем действии.

Активный ил анаэробных очистных систем

Анаэробные процессы применяются в практике очистки менее широко, чем аэробные. В последнее время возрастает интерес к метановому сбраживанию концентрированных углеродсодержащих субстратов, которое осуществляется сообществом анаэробных микроорганизмов. Для сточных вод пищевых предприятий применение метанового сбраживания весьма перспективно, поскольку позволяет достичь более благоприятного соотношения С/N для последующей аэробной доочистки, получить энергетическое сырье, поддержать достаточную температуру последующего аэробного процесса в зимний период.

Метановая ферментация на современным представлениям протекает в три стадии (Схема 1) .

Полное анаэробное расщепление органического вещества происходит под влиянием трех основных групп бактерий (см. схему 1): (1) — гидролизующих; (2) — облигатных ацетогенных; (3) — ацетогенных; (4) — метаногенных. Первая стадия - гидролиз сложных соединений, биополимеров и конверсия продуктов в летучие жирные кислоты, спирты, альдегиды, диоксид углерода, аммиак, водород. Эти процессы осуществляются самыми разнообразными микроорганизмами, относящимися к аэробам, факультативным анаэробам, облигатным анаэробам. В анаэробной микрофлоре обнаружены бактерии рода Clostridium, обладающие протеолитической активностью, целлюлозоразрушающие — Васterioides rominicola, Butyrivibrio fibrisolvens, пектиноразрушающие, маслянокислые, пропионовокислые.

Состав микрофлоры первой стадии анаэробной ферментации определяется составом питательной среды. Преобладание тех пли иных классов органических соединений - белков, углеводов, жиров - вызывает преимущественное развитие родов и видов микроорганизмов, способных к разложению соответствующих субстратов.

На второй стадии - образования уксусной кислоты, водорода и диоксида углерода — биологическими агентами являются облигатные ацетогенные бактерии, из которых выделено и исследовано всего несколько видов. В целом как группа эти микроорганизмы расщепляют пропионовую и другие жирные кислоты, некоторые соединения, образующиеся после первой стадии анаэробной ферментации. Продуктами расщепления являются уксусная кислота, водород, диоксид углерода. Третья стадия — метаногенная — изучена наиболее подробно как в отношении механизма образования метана, так и состава микрофлоры. Метаногенные бактерии — единственные организмы, способные трансформировать кислоты и водород в газообразный метан без внешних источников энергии или акцепторов электронов. Метаногены - уникальная группа, состоящая из самых разных видов и форм бактерий, растущих в строго анаэробных условиях.

Приблизительно 65 - 70% метана образуется за счет метильной группы уксусной кислоты. Остальное количество образуется из диоксида углерода и водорода бактериями рода Methanosarcina. Таким образом, разложение органических субстратов до СО2 и СН4 происходит при совместном культивировании трех групп бактерий. Каждая из этих групп развивается на определенных субстратах и в весьма ограниченных диапазонах внешних условий. Тем не менее они сосуществуют в одном объеме анаэробного реактора и при непрерывном культивировании могут рассматриваться как один биоценоз, сбраживающий сложный субстрат.

Другим важным анаэробным процессом является процесс денитрификации, потекающий при доочистке сточных вод пищевых предприятий с высоким содержанием азота. В настоящее время установлено, что бактерии, осуществляющие анаэробную очистку, способны восстанавливать нитритный азот в анаэробных условиях. Бактерии родов Achromobacter, Alkalingenes, Bacillus, Micrococcus, Pseusomonas, Acinetobacter восстанавливают соединения азота до N₂, а Flavobacterium, Prosteus восстанавливают нитриты до нитратов. Эти бактерии относятся к хемоорганогетеротрофам, т.е. в анаэробных условиях при окислении ими органических веществ конечным акцептором электрона служит молекулярный кислород, а в анаэробных – кислород нитратов и нитритов.

Амидолитичсская и денитрифицирующая активность после максимума при 30 °С снижается с ростом температуры, а затем при 60 °С снова увеличивается. Численность микроорганизмов, обладающих целлюло-золитической активностью, в диапазоне 20-30 °С стабильна, а при 40 °С эта группа не обнаруживается.

Данные о динамике численности микроорганизмов различных физиологических групп можно использовать при выборе режима функционирования очистных систем для создания оптимальных условий обезвреживания загрязнений в сточных водах.

Близким по значению для контроля процесса очистки является метод определения ферментативной активности биомассы .активного ила. В отличие от физиологической активности ферментативная активность измеряется по убыли специфического субстрата при инкубации его в течение короткого времени с активным илом. Предполагается использовать этот метод в системах автоматического контроля вместо определения БПК и концентрации активного ила.

1. Генетическая инженерия: сущность и задачи. Введение и экспрессия чужеродных ДНК в клетках реципиентов. Значение в медицине и сельском хозяйстве.

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний. Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания. Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками.

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы: - специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;- быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;- конструирование рекомбинантной ДНК;- гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;- клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий; - введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.

Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Рестриктазы

Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции) - это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).

Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий; их существование играет важную роль в защите резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения. Рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК была выделена в 1968 г. Мезельсоном и Юанем. Этот фермент был высокоспецифичен по отношению к определенной последовательности ДНК.