Обратная транскриптаза

Обратная транскриптаза используется для транскрипции м-РНК в комплементарную цепь ДНК. При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина.

В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. Усилия, направленные на выделение такого фермента, увенчались успехом, и в 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор открыли искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза.

Наиболее детально изучена ревертаза ретровирусов птиц. Каждый вирион содержит около 50 молекул этого фермента. Обратная транскриптаза состоит из двух субъединиц — a (65 кДа) и b (95 кДа), присутствующих в эквимолярном количестве. Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;

2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК—ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro", что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т.д.

Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

Искусственно созданная рекомбинантная ДНК вводится в организм хозяина с помощью вектора - молекулы нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемой для передачи генетического материала другой клетке. Затем осуществляют отбор генетически измененных форм на селективной питательной среде (с включением антибиотика).

С помощью генной инженерии создают вакцины, синтезируют белки, активные метаболиты, лечат наследственные заболевания. В сельском хозяйстве улучшают сорта растений и породы животных, нарабатывают антибиотики и пищевые добавки.

1. Основные практические направления и перспективы генноинженерной биотехнологии животных. Трансгенные организмы и их значение.

Постгеномная эра в первой декаде XXI-ого века подняла на новый уровень развитие генной инженерии. Так называемый Кельнский Протокол «На пути к биоэкономике, основанной на знаниях», определил биоэкономику как «преобразование знаний наук о жизни в новую, устойчивую, экологически эффективную и конкурентоспособную продукцию». Дорожная карта генной инженерии содержит целый ряд направлений: генотерапия, биоиндустрия, технологии, основанные на стволовых клетках животных, ГМ растения, ГМ животные и т.д.

Генетически модифицированные животные

Клетки животных существенно отличаются от бактериальных по своей способности поглощать чужеродную ДНК, поэтому методы и способы способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и рыб остаются в центре внимания генных инженеров.

Наиболее изученное в генетическом отношении млекопитающее – мыши. Первый успех относится к 1980 году, когда Д. Гордон с сотрудниками продемонстрировал возможность введения и интеграции чужеродной ДНК в геном мышей. Интеграция была стабильной и сохранялась у потомства. Трансформацию производят микроинъекцией клонированных генов в один или оба пронуклеуса (ядра) только что эмбриона на стадии одной клетки (зиготы). Чаще выбирают мужской пронуклеус, привнесенный сперматозоидом, так как его размеры больше. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной матери, или дают возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген ?-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей. Число молекул, вводимое за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000, а их размер – от 5 до 50 кб. Выживает обычно 10 – 30% яйцеклеток, а доля мышей, родившихся из трансформированных яйцеклеток варьирует от нескольких до 40%. Таким образом, реальная эффективность составляет около 10%.

Таким методом получены генно-инженерные крысы, кролики, овцы, свиньи, козы, телята и другие млекопитающие. В нашей стране получены свиньи, несущие ген соматотропина. Они не отличались по темпам роста от нормальных животных, но изменение обмена веществ сказалось на содержании жира. У таких животных ингибировались процессы липогенеза и активировался синтез белка. К изменению обмена веществ приводило и встраивание генов инсулиноподобного фактора. ГМ свиньи были созданы для изучения цепочки биохимических превращений гормона, а побочным эффектом явилось укрепление иммунной системы.

Самая мощная белоксинтезирующая система находится в клетках молочной железы. Если поставить гены чужих белков под контроль казеинового промотора, то экспрессия этих генов будет мощной и стабильной, а белок будет накапливаться в молоке. С помощью животных-биореакторов (трансгенные коровы) уже получено молоко, в котором содержится человеческий белок лактоферрин. Этот белок планируется применять для профилактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью: больные СПИДом, недоношенные младенцы, больные раком, прошедшие радиотерапию.

Важное направление трансгеноза – получение устойчивых к болезням животных. Ген интерферона, относящийся к защитным белкам, встраивали различным животным. Трансгенные мыши получили устойчивость – они не болели или болели мало, а вот у свиней такого эффекта не обнаружено.

Генная инженерия для сельского хозяйства

Генетическое улучшение сельскохозяйственных культур и декоративных растений представляет собой длительный и непрерывный процесс с использованием все более точных и предсказуемых технологий. В научном отчете ООН (за 1989 год) сказано следующее: «Поскольку молекулярные методы наиболее точны, те, кто их применяет, в большей степени уверены в том, какими признаками они наделяют растения, и, следовательно, реже получают незапланированные эффекты, чем при использовании обычных методов селекции.»

Преимущества новых технологий уже широко используются в таких странах, как США, Аргентина, Индия, Китай и Бразилия, где генетически модифицированные культуры возделывают на больших территориях.

Новые технологии также имеют большое значение для малоимущих фермеров и жителей бедных стран, особенно женщин и детей. Например, генетически модифицированные, устойчивые к вредителям, хлопчатник и кукуруза требуют применения инсектицидов в значительно меньших объемах (что делает труд на ферме более безопасным). Такие культуры способствуют повышению урожайности, получению фермерами более высоких доходов, снижению уровня бедности и риска отравления населения химическими пестицидами, что особенно характерно для ряда стран, в том числе для Индии, Китая, ЮАР и Филиппин.

Самыми распространенными ГМ растениями являются культуры, устойчивые к недорогим, наименее токсичным и наиболее широко используемым гербицидам. Возделывание таких культур позволяет получать более высокий урожай с гектара, избавиться от изнурительной ручной прополки, тратить меньше средств за счет минимальной или беспахотной обработки земли, что, в свою очередь, приводит к снижению эрозии почвы.

В 2009 году произошла замена генетически модифицированных культур первого поколения продуктами второго поколения, что впервые привело к увеличению урожайности per se. Пример биотехнологической культуры нового класса (над созданием которой работали многие исследователи) – устойчивая к глифосату соя RReady2Yield™ , выращивалась в 2009 году в США и Канаде более чем на 0.5 миллионах га.

В 2009 году в 25 странах мира выращивали ГМ культуры на площади 134 млн. га (что составляет 9% от 1,5 млрд. га всех пахотных земель в мире). Шесть стран ЕС (из 27) возделывали Bt кукурузу, и в 2009 году площади ее посевов достигли более 94 750 га. Анализ мирового экономического эффекта использования биотехнологических культур за период с 1996 по 2008 г.г. показывает рост прибыли в размере 51,9 миллиардов долларов благодаря двум источникам: во-первых, это сокращение производственных затрат (50%) и, во-вторых, значительная прибавка урожая (50%) в размере 167 миллионов тонн.

В 2009 году общая рыночная стоимость семян ГМ культур в мире составила 10.5 миллиардов долларов. Общая стоимость по зерну биотех кукурузы и сои, а также хлопчатника в 2008 году составила 130 млрд. долларов, и ожидается, что ее ежегодный рост составит 10 – 15%.

ДЛЯ ЧЕГО ИСПОЛЬЗУЮТ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ СЕГОДНЯ

Трансгенные животные, несущие чужеродный ген гормона роста

Такие животные отчасти уже история трансгеноза млекопитающих. После получения гигантской трансгенной мыши делались попытки в такой же мере увеличить размеры и более крупных млекопитающих, но эти работы оказались неудачными. Животные с повышенным уровнем продукции гормона роста не увеличились в размерах, но у них наблюдались разнообразные нарушения в росте и строении костей скелета, например акромегалия. По-видимому, запас возможного увеличения размера у сельскохозяйственных животных уже был выбран предшествующей многовековой селекцией, которая велась именно на увеличение роста и веса животного. Однако эти работы сыграли свою роль для изучения функционирования чужеродного гена в организме трансгенного животного и нашли применение в создании быстрорастущих трансгенных рыб.

Трансгенные животные – биореакторы

Биореакторами называют организмы, продуценты лекарственных белков. Биореакторами могут быть любые живые организмы – бактерии, грибы, растения, животные – и даже клеточные культуры. У каждого из таких организмов-биореакторов есть достоинства и недостатки. Бактерии, например, легко модифицируются методами генной инженерии, быстро размножаются и их удобно использовать в промышленных биотехнологических установках. Таким методом производят генноинженерный инсулин человека – в настоящее время наиболее качественный из получаемых промышленным спосо-

бом инсулинов. Однако для нормального функционирования белков человека очень важны те изменения, которые происходят на посттрансляционном уровне: гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование, карбоксилирование и некоторые другие преобразования. Большая часть биохимических механизмов, обеспечивающих эти процессы, отсутствует у прокариот, и белки, синтезируемые ими с матриц генов человека, не полностью идентичны белкам из клеток человеческого организма. Другая сложность связана с выделением и очисткой лекарственного белка – бактериальные клетки идут в переработку целиком, и поэтому трудно избавиться от всех посторонних примесей в конечном продукте. Трансгенные дрожжевые культуры и культуры клеток человека не имеют этих недостатков, но продуктивность таких систем в настоящее время ниже, чем та, которая уже получена у экспериментальных трансгенных животных.

Несмотря на активное развитие биотехнологии в последние десятилетия, основным источником многих необходимых фармакологии лекарственных белков человека является донорская кровь. Это факторы свертываемости крови – фибрионоген, антитромбины, альбумин, иммуноглобулины и другие белки, без использования которых трудно представить себе современную медицину. Достаточное количество качественных и де-шевых лекарственных белков человека могло бы спасти многих пациентов. Эта задача и легла в основу работ по получению трансгенных животных – продуцентов белков человека.

Стратегия этих работ такова: получить трансгенное животное, у которого чужой ген экспрессируется в клетках молочной железы и продукт работы этого гена выделяется в молоко. Тогда получение лекарственного белка сведется к процессу, известному человеку уже много тысяч лет, – к дойке. Хотя мы привыкли к тому, что аппаратами механического доения обычно доят коров, но есть аппараты, дающие возможность подоить козу, овцу, свинью, кролика и даже мышь. Трансгенные животные позволят решить и еще одну проблему – проблему очистки лекарственных белков. Даже если после очистки в препарате останутся примеси, это будут нетоксичные для человека белки молока.

В настоящее время активно ведутся работы по получению животных, продуцентов рекомбинантных иммуноглобулинов человека – они появятся в ближайшие годы, и область их применения почти безгранична.

Создание животных – генетических моделей наследственных заболеваний человека

Многие болезни имеют наследственные причины. И это касается не только моногенных заболеваний, происходящих из-за мутации в каком-нибудь одном определенном гене. Часто причиной заболевания является целый комплекс нарушений генома: присутствие аллелей, определяющих склонность к заболеванию, гиперфункция каких-либо генов из-за наличия дополнительных копий этого гена или нарушений в его регуляции и по многим другим, но генетически предопределенным причинам. К этой группе относятся большая часть заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем, многие эндокринные заболевания. Часто трудно установить конкретную причину заболевания, соотнести обнаруженные у пациента генетические дефекты с его анамнезом. В последние 10 лет для решения этих вопросов все чаще привлекаются трансгенные модели наследственных заболеваний человека.

При дальнейшем развитии трансгенных технологий возможно появление совершенно новых отраслей их использования. Многие из этих направлений кажутся совершенно фантастическими, однако именно сегодня разрабатываются стратегические подходы для этих направлений исследований и будущие возможности активно обсуждаются в научных изданиях. В основе большей части этих прогнозов – создание трансгенных животных, у которых одни гены нокаутированы, а другие, наоборот, введены в состав генома. Создание таких мультитрансгенных животных и предполагается в ближайшем будущем.