Студопедия

КАТЕГОРИИ:

АстрономияБиологияГеографияДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника


ГЛАВА 5 4 страница




Один из возможных подходов к стабилизации чужеродных белков, синтезируемых E, coli, состоит в использовании хозяйских штаммов с дефицитом протеолитических ферментов. Однако здесь есть свои трудности. В клетках E. coli синтезируется по крайней мере 25 разных протеиназ, и только некоторые из них изучены на генетическом уровне. Кроме того, протеиназы выполняют в клетке очень важную функцию, разрушая чужеродные или дефектные белки и обеспечивая тем самым жизнеспособность клеток. В одной из работ были сконструированы штаммы, несущие мутации в одном или даже нескольких протеиназных генах, и чем более выражен был суммарный дефицит по протеиназам, тем хуже рос штамм. Таким образом, снижение протеиназной активности приводит к истощению клеточных ресурсов. И все же удалось создать штаммы E. coli, несущие мутации в гене сигма-фактора РНК-полимеразы, ответственного за синтез белков теплового шока (rpoН), и в гене протеиназы, необходимой для роста клеток при высоких температурах (degP), y которых удельная активность секретируемых белков была в 36 раз выше, чем у штаммов дикого типа. Это кажущееся увеличение было обусловлено снижением интенсивности протеолитического расшепления белков.

Бактериальный «гемоглобин»

Местообитанием некоторых штаммов грамотрицательных облигатных аэробных бактерий Vitreoscilla являются сильно обедненные кислородом непроточные водоемы. Чтобы получать нужное количество кислорода для роста и метаболизма, они синтезируют гемоглобиноподоб-ное вещество, связывающее кислород окружающей среды и увеличивающее концентрацию доступного кислорода в клетке. Когда ген, кодирующий этот белок, был введен в клетки E. coli, в последних сразу произошли серьезные изменения: повысился уровень синтеза клеточных и рекомбинантных белков, возросла эффективность протонных насосов, увеличилось количество образующегося АТР и его концентрация, особенно при низком содержании кислорода в среде. Чтобы такую стратегию можно было ис-


Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах 123

 

пользовать применительно к другим хозяйским клеткам, необходимо, чтобы эти клетки не только эффективно экспрессировали «гемоглобиновый" ген Vitreoscilla, но и синтезировали гем -составляющую гемоглобиновой молекулы. Это позволит улучшить рост таких важных в коммерческом отношении бактерий, как Е. coli, Streptomyces lividansr Corynebacterium glutarnicum и Xanlhomonas maltophilia, а также осуществлять в них экспрессию чужеродных генов.

Интеграция чужеродной ДНК в хромосому хозяина

При наличии вклетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. При этом, как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем малоколийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции утрачивает плазмиды. Клетки, лишившиеся своих плазмид, обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились, и в конечном счете оказываются в культуре преобладающими. По прошествии нескольких генераций это отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Разработано по крайней мере два подхода к решению этой проблемы. В лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Однако добавление антибиотиков и какихто других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные ферментеры приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены сохранялись, не утрачиваясь и не передаваясь другим микроорганизмам, в том случае, когда сконструированный микроорганизм предназначен для использования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов.

При встраивании нужного гена в хромосомную ДНК хозяина нужно позаботиться о том, чтобы сайт интеграции не находился внутри гена, кодирующего важную клеточную функцию. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный сайт. Кроме того, для обеспечения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора. Для интеграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с таковой в хромосомной ДНК, в пределах которых и должен произойти физический обмен (рекомбинация) между двумя молекулами ДНК. Вкратце процесс интеграции состоит в следующем.

1. Идентификация подходящего сайта интеграции, т. е. сегмента хозяйской ДНК, последовательность которого может быть прервана без ущерба для функционирования клетки.

2. Выделение и клонирование всего хромосомного сайта интеграции или его части.

3. Встраивание нужного гена вместе с регулируемым промотором в клонированный сайт интеграции {рис. 6.15, А) или вблизи него (рис. 6.15, Б).

4. Перенос полученной генетической конструкции «хромосомный сайт интеграции/клонированный ген» в хозяйскую клетку в составе плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого хозяина.

5. Отбор и сохранение тех хозяйских клеток, которые экспрессируют клонированный ген. Наследование клонированного гена возможно только в случае его интеграции в хромосому клеток хозяина.

Если клетка трансформирована нереплицируюшейся плазмидой, несущей клонированный ген в середине клонированного фрагмента с хромосомным сайтом интеграции, то может произойти спаривание между гомологичными нуклеотидными последовательностями плазмиды и хозяйской ДНК (рис. 6.15, А) и далее интеграция в результате двойного кроссинговера, осуществляемого ферментами клетки-хозяина. Альтернативный вариант - интеграция всей плазмидной ДНК в хромосому хозяина в результате одиночного кроссинговера (на рисунке не показано). Интеграция всей плазмиды может произойти и в том случае, если клонированный


124 ГЛАВА 6

 

Рис. 6.15. Два способа интеграции клонированного в плазмиде гена в хромосому. А. Ген встроен в середину клонированного в плазмиде сегмента ab, гомологичного сегменту a'b' в хромосомной ДНК. В результате двойного кроссинговера (Χ-Х) клони- рованный ген оказывается в составе хромосомы. Б. Ген встроен вблизи клонированного в плазмиде сегмента с, гомологичного сегменту с' в хромосомной ДНК. В результате одиночного кроссинговера (X) происходит интеграция в хромосому всей плазмиды вместе с включенным в нее геном.

ген встроен вблизи клонированного хромосомного сайта интеграции.

Для проверки эффективности интеграции клонированного гена использовали В. subtilis. Была сконструирована плазмида Е. соli, содержащая ген α-амилазы (фермента, участвуюшего в гидролизе крахмала) Bacillus amyloliquefaciens, встроенный в середину фрагмента ДНК из В. subtilis. Она была неспособна реплицироваться в этом микроорганизме, но ею можно было трансформировать клетки Б. sitbtilis. Обнаруженные трансформанты синтезировали α-амилазу, что свидетельствует об интеграции гена, кодирующего данный фермент, в хромосому В. subtilis, и о его функционировании. Отобранные рекомбинанты были устойчивы к ампициллину и хлорамфениколу. Поскольку оба гена устойчивости находились в плазмиде, было очевидно, что произошла одиночная рекомбинация, в результате которой вся плазмида включилась в хромосомную ДНК В. sitbtilis.

Чтобы увеличить число копий гена α-амилазы, локализованных в хромосоме В. subtilis, ис-


Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах 125

 

ходные трансформанты выращивали в присутствии хлорамфеникола в высокой концентрации. В таких условиях выживали только те клетки, в которых происходила спонтанная дупликация интегрированной плазмиды. Клетки, отобранные по признаку устойчивости к хлорамфениколу, проверяли на активность α-амилазы (табл. 6.5). После такой процедуры были получены клетки, содержащие до 9 копий гена α-амилазы. Уровень ферментативной активности в клетках, содержащих α-амилазные гены в составе хромосомы, была гораздо выше, чем в том случае, когда эти гены находились в многокопийной плазмиде (от 20 до 40 копий на клетку) В. subtilts.

В одном из исследований несколько копий чужеродного гена было встроено в разные заранее выбранные сайты в хромосоме В. sitbtilis, при этом для каждой из копий использовалась двух-этапная процедура (рис. 6.16), На первом этапе

 

Таблица 6.5, Связь между числом копий гена α-амилазы и уровнем ее активности в клетках В. subtilis1)

Число копий иа геном Активность, ЕД на 1 мл культуры, находящейся в середине экспоненциальной фазы
Многокопийная плазмида

1) По данным работы Kallio et al., I987. Appl. Micrcbiol. Biotechnol. 27: 64-71.

 

выбирали селективный маркерный ген (например, ген устойчивости к какому-либо антибиотику) и встраивали его в середину вполне определенного, но несущественного фрагмента хромосомной ДНК В. subtilis в составе плазмид-

 

Рис. 6.16. Встраивание чужеродного гена в заранее выбранный сайт в хромосоме В. subtilis. На этапе 1 в хромосомную ДНК хозяйской клетки с помощью гомологичной рекомбинации встраивают маркерный ген. На этапе 2 маркерный ген замещают геном-мишенью. Аналогичную операцию повторяют для других сайтов.

126 ГЛАВА 6

 

ного вектора, не способного к репликации в этом микроорганизме. Отбирали клетки, экспрессиру-ющие маркерный ген, т. е. клетки, у которых этот ген включился в хромосомную ДНК. На втором этапе ген-мишень с соответствующими сигналами инициации транскрипции и трансляции, введенный в середину такого же, как и выше, несущественного фрагмента хромосомной ДНК В. subtilis в составе плазмиды, включали в хромосомную ДНК с помощью рекомбинации, заменив им маркерный ген. Отбирали клетки, которые уже не экспрессировали маркерный ген, т. е. несли вместо него ген-мишень, интегрированный в хромосомную ДНК. Для интеграции других копий гена-мишени в хромосомную ДНК хозяйской клетки повторяли эту процедуру, используя другие несущественные области ДНК.

Повышение эффективности секреции

Стабильность белков, кодируемых клонированными генами, зависит от их клеточной локализации. Например, рекомбинантный проинсулин оказывается примерно в 10 раз более стабильным, если он секретируется (экспортируется) в периплазму (пространство между плазматической и наружной мембранами), а не остается в цитоплазме. Кроме того, белки, секретируемые в периплазму или в среду, легче очистить.

Обычно транспорт белков через клеточную мембрану обеспечивают N-концевые аминокислотные последовательности, называемые сигнальными пептидами (сигнальными последовательностями, лидерными пептидами). Иногда удается сделать белок секретируемым, присоединив к кодирующему его гену нуклеотидную последовательность, ответственную за синтез сигнального пептида. Однако простое наличие сигнального пептида не обеспечивает эффективной секреции. Кроме того, E. coli и другие грамотрицательные микроорганизмы обычно не могут секретировать белки в окружающую среду из-за наличия наружной мембраны. Есть по крайней мере два способа решения этой проблемы. Первый — использование грамположительных про- или эукариот, лишенных наружной мембраны, второй — создание грамотрицательных бактерий, способных секретировать белки в среду, с помощью генной инженерии.

Если слияние гена-мишени с фрагментом ДНК, кодирующим сигнальный пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы. Один из таких приемов, с успехом примененных в отношении ин-терлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодирующим полноразмерный предшественник мальтозосвязывающего белка, а не только его сигнальную последовательность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Ха. Когда такой химерный ген включили в плазмидный вектор и использовали его для трансформации E. coli, в периплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обработав его фактором Ха, получили функциональный интерлейкин-2.

По данным одной из работ, секреция многих гетерологичннх белков в E. coli зависит от уровня экспрессии соответствующих генов. Чужеродные белки, синтезируемые наиболее активно, не обязательно столь же активно секретируются. Иногда интенсивный синтез чужеродного белка вызывает перегрузку секреторного аппарата и его блокирование. Таким образом, если нужно, чтобы данный белок непременно секретировался, то можно попытаться понизить уровень экспрессии соответствующих генов.

Некоторые грамотрицательные бактерии секретируют в среду белок, называемый бактериоцином. Он активирует фосфолипазу А, локализованную во внутренней мембране бактериальной клетки, в результате чего и внутренняя, и наружная мембраны становятся проницаемыми, и некоторые цито- и периплазматические белки высвобождаются в культуральную среду. Таким образом, можно встроить ген бактериоцина в плазмиду так, чтобы он находился под контролем сильного регулируемого промотора, трансформировать клетки E. coli этой плазмидой и сделать их проницаемыми. Если же E. coli уже несут ген бактериоцина, их можно трансформировать другой плазмидой, которая содержит ген нужного белка, сшитый с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, Если оба гена находятся под контролем одного промотора, то их можно индуцировать одновре-


Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах 127

 

менно, и белок клонированного гена будет секретироваться в среду.

Когда секретируемые чужеродные белки образуются в Е. coli в слишком большом количестве, очень часто процессинг претерпевают не все белки-предшественники: примерно половина секретированных белков сохраняет лидерную последовательность, а другая половина полностью процессируется с образованием зрелой формы. Это может быть связано с недостатком каких-то белков, участвующих в секреции. В такой ситуации, чтобы увеличить долю процесси-рованных белков, можно попытаться повысить уровень экспрессии генов, ответственных за синтез лимитирующих компонентов секретиру-юшей системы. Для проверки этого предположения были поставлены следующие эксперименты. Плазмиду, несущую гены prlA4 и secE, которые кодируют основные компоненты молекулярного механизма, ответственного за физическое перемещение белков через мембрану, ввели в клетки E. соli. После такого усиления секреторного аппарата хозяйской клетки доля ре-комбинантного белка (цитокина интерлейкина-6), секретируемая в плазмиду в зрелой форме, увеличилась с 50 до более чем 90%.

Грибы Aspergillus cекретируют в среду большое количество ферментов и широко используются для их промышленного производства. В одной из работ осуществили слияние гена человеческого интерферона с геном сигнального пептида, ответственного за секрецию, и поместили эту конструкцию под контроль глюкоамилазного промотора Aspergitlus nidulans, индуцируемого крахмалом. После добавления последнего в среду с трансформированными клетками Aspergillus nidulans выход секретируемого человеческого интерферона достиг 1 мг на 1 л, что эквивалентно примерно 5% всего секретируемого клеточного белка. Эта работа показывает, что стратегии модулирования генной экспрессии, разработанные для Е, соli, можно использовать и применительно к другим биологическим системам.

 

Метаболическая перегрузка

Введение в клетку чужеродной ДНК и ее экспрессия часто приводят к нарушениям клеточного метаболизма. Эти нарушения весьма разнообразны и обусловлены давлением, которое оказывает чужеродная ДНК на все клеточные процессы. Метаболическая перегрузка может возникать по разным причинам.

• Увеличение числа копий и/или размера плазмид и связанное с этим увеличение количества энергии, необходимого для их репликации и сохранения,

• Недостаток растворенного кислорода в среде и невозможность обеспечения им и всех метаболических реакций, и процесса экспрессии плазмидных генов,

• Гиперпродукция чужеродных белков, приводящая к истощению пула некоторых аминоацил-тРНК (или даже некоторых аминокислот) и/или энергетических запасов (в виде АТР и GTP).

• Перегрузка системы экспорта и нарушение правильной локализации жизненно важных белков хозяйской клетки вследствие «перепроизводства" чужеродного белка, экспортируемого из цитоплазмы к клеточной мембране или в пери плазматическое пространство.

• Наличие у организма-хозяина необычных метаболических свойств (например, высокая дыхательная активность у Azotobacter spp.), что делает его более чувствительным к различным воздействиям, чем обычные клетки.

• Непосредственное влияние чужеродных белков на функционирование хозяйской клетки (например, превращение с их помощью важных незаменимых предшественников в неприемлемые, а иногда и токсичные соединения).

Метаболическая перегрузка может привести к разнообразным изменениям в физиологии и функционировании хозяйской клетки. Одно из наиболее частых — снижение скорости роста клеток после введения чужеродной ДНК. Так, клетки, содержащие плазмиду, растут медленнее, чем нетрансформированные, не содержащие плазмид (табл. 6.6), что часто сопровождается утратой рекомбинантной плазмиды. Иногда метаболическая перегрузка приводит к тому, что под давлением отбора из плазмиды делегируется рекомбинантный ген или его часть.



Поделиться:

Дата добавления: 2015-04-16; просмотров: 85; Мы поможем в написании вашей работы!; Нарушение авторских прав





lektsii.com - Лекции.Ком - 2014-2024 год. (0.005 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав
Главная страница Случайная страница Контакты