Стратегия клонирования в дрожжевых клетках

Клонирование в дрожжах. Среди дрожжей наиболее полно и чен вид S. cerevisiae. У этого вида в гаплоидных клетках содержи 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколько сой генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно р| лицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плазмида Scp| cerevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50—г^ копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно и используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что подоб­но бактериям они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, а такие имеют сравнительно короткое время реге­нерации (несколько часов) вследствие малого размера генома.

Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно про­ста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкубиру­ют с ДНК в присутствии СаС12 и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкуба­ция сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных реком- бинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компо­нент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попада­нии в клетку-хозяина придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать коло­нии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные ис­пользовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки по­добно В. subtilis секретируют большое количество белка во вне­клеточную среду, что используется также для секреции чужерод­ных белков, например интерферона человека.

145.Стратегия клонирования в клетках млекопитающих:

Клонирование в клетках животных. Проблема введения генов в клетки млекопитающих очень важна для исследования функцио­нирования генов высших эукариот.

Предварительно клонированные гены вводят в клетку живот­ных различными путями. Суть одного из них состоит в трансфор­мации клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и пос­ледующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода мар­кера. Примером может служить метод получения клеток, дефект­ных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК~-клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК+-клетками. Клетки ТК+ легко отлича­ются от клеток ТК~, поскольку способны расти на средах с ами- ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии био­синтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следователь­но, в данном случае для трансформации клеток животных были использованы гибриды бактериальных плазмид с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирова­ние и идентификацию генов в клетках Е. coli и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК~-клетки. Анализ мето­дом бдот-гибридизации подтвердил, что выжившие клетки со­держали интегрированный в геном ТК-ген вируса герпеса.

Селективные маркеры дают возможность вводить в клетки мле­копитающих любой ген, заранее лигированный с клонирован­ным селективным маркером.

Представляют немаловажный интерес микроинъекции ДНК не-посредственно в ядро клетки. Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы, и плазмиды pBR322 были инъецированы в ТК-клетки, при этом ТК-ген проник в ядра и нормально в них реплицировался.

Трансформация соматических клеток млекопитающих открывает возможность для изучения механизмов регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, в том числе и человека. Культуры клеток млекопитающих могут быть эффективным источником выделения ряда вирусных антигенов с целью получения вакцин для животных и человека.

В настоящее время разработаны способы введения генов в эмб-риональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с целью изменения свойств организма, таких, как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Подобного рода работы были начаты с довольно крупными яйцами амфибий, а затем продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мыши.