Челночные векторы (бинарные)

Интегрирующая плазмида pFH7 получена путем объединения 2 репликонов, один из которых берет начало от плазмиды pC194 B.subtilis, а другой от плазмиды pBR322 E.coli, что дает возможность вектору существовать стабильно реплицироваться как в клетках B.subtilis, так и E.coli. Такие векторы, способные реплицироваться в клетках-хозяевах разных биологических видов, называют челночными или бинарными. Принципы конструирования и функционирования челночных векторов одинаковы, они должны включать в себя репликоны тех генетических систем, в которых будет происходить репликаця челночного вектора.

Примерами челночных векторов являются плазмидные ДНК, способные реплицроваться в клетках высших (жив. и растений) и низших организмов. Необходимость использования челночных векторов в генной инженерии связана с тем, что наработку в препаративном количестве векторной ДНК для проведения генно-инженерных манипуляций удобно проводить в бактериальных клетках, тогда как получение биологически активных продуктов клонированных генов высших организмов во многих случаях возможно только в клетках своего или близкого вида, в которых эти гены экспрессируются в природных условиях, т.е. в своем обычном генетическом окружении.

136.Векторные системы для клонирования в клетках дрожжей:

Клонирование в дрожжах. Среди дрожжей наиболее полно и чен вид S. cerevisiae. У этого вида в гаплоидных клетках содержи 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколько сой генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно р| лицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плазмида Scp| cerevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50—г^ копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно и используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что подоб­но бактериям они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, а такие имеют сравнительно короткое время реге­нерации (несколько часов) вследствие малого размера генома.

Процедура выделения ДНК в клетки дрожжей довольно про­ста. Обычно целлюлозную клеточную стенку удаляют обработкой ферментами, получая так называемые сферопласты. Их инкубиру­ют с ДНК в присутствии СаС12 и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкуба­ция сферопластов в среде с агаром восстанавливает клеточную стенку. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных реком- бинантными плазмидами, основана на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, в которой отсутствует тот или иной питательный компо­нент. Векторная плазмида содержит гены, которые при попада­нии в клетку-хозяина придают ей этот недостающий признак. Трансформанты легко отбираются по их способности давать коло­нии на обедненной среде. Применяя приемы, аналогичные ис­пользовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Эти клетки по­добно В. subtilis секретируют большое количество белка во вне­клеточную среду, что используется также для секреции чужерод­ных белков, например интерферона человека.

Известны 5 типов дрожжевых векторов: YIp – не способны реплицироваться в дрожжевых клетках, но осуществляют их трансформацию путём интеграции в гомологичный участок хромосомы путём двойного кроссинговера. Сконструирован на основе плазмиды ColEI и маркера Leu2.

Вектор YEp. Состоят из плазмиды pBR322, репликатора 2-микронной плазмиды и дрожжевого селективного маркера. Для поддержания вектора в дрожжах являются сайты ori и STB 2-микронной плазмиды. Маркирован LEU2.

Вектор YRP.Имеют хромосомныерепликаторы ARS. Способен к автономной репликации. Нестабилен. Применяется когда появляется необходимость иметь умеренное число копий клонируемого гена.

Вектор YCp –кромехромосомных репликаторовсодержат центромерыдрожжевых хромосом. Проявляет стабильность при митозе и мейозе. Хотя и меньшую, чем ествественные хромосомы. В процессе мейоза вектора сегрегируют по Менделю, с образованием кольцевых мини-хромосом.

Вектор YLp – создан на базе вектора YRp путём их линеаризации и присоединения к концам теломер взятых из внехромосомной линейной рДНК ресничной инфузории. Вектор использовали для клонирования дрожжевых теломер и анализа их структуры.