Упаковочная система фага лямбда.

Для фага X, часто используемого в качествемолекулярного вектора клеток Е. coli, разрабо-тан метод упаковки ДНК in vitro в капсиды. Дляэтого требуются концентрированные экстрактыклеток, индуцированных из лизогенного состоя-ния. Используются мутанты фага, имеющие де-фекты по разным генам белков головки капсида.Каждый из таких мутантов не способен образо-вывать полноценные фаговые частицы и упако-вывать свою ДНК. При смешении же фаговойДНК и белковых экстрактов клеток, в которыхразвивались мутанты, происходит комплемен-тация недостающих функций и собираются ин-фекционные частицы. Биологическую актив-ность эндогенной фаговой ДНК в экстрактахобычно подавляют УФ-облучением. Сформированными in vitro частицами мож-но заражать клетки Е. coli и получать фаговоепотомство. Эффективность упаковки ДНК фа-га Я in vitro обычно составляет 10~2—10~3.

Важной особенностью данного подхода яв-ляется то, что в капсид преимущественно упа-ковываются молекулы фаговых ДНК, имеющиеразмер, близкий к размеру фагового генома. Этопозволяет после реакции лигирования фрагмен-тов осуществлять селекцию гибридных моле-кул ДНК in vitro по размеру. Кроме того, в кап-сиды не упаковываются многочисленные по-бочные продукты лигазной реакции. Поэтомуобразовавшиеся после упаковки фаговые части-цы инъецируют в бактериальные клетки лишьфаговые ДНК заданного размера. При клониро-вании фрагментов в векторных молекулах ДНКфага X обычно используют именно этот методвведения гибридных ДНК в клетку. Данный при-ем также необходим при клонировании фраг-ментов ДНК в составе космид и фазмид.

Фаговая частица бактериофага λ имеет головку, в которой заключена плотно упакованная ДНК длиной примерно 50 т. п. н., и отросток с отходящими от него тонкими белковыми нитями (фибриллами). Сборка головки и отростка и упаковка ДНК четко скоординированы. ДНК фага λ — это линейная двухцепочечная молекула длиной 50 т. п. н. с одноцепочечными 5'-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом. После того как фаговая ДНК проходит через отросток и попадает в E. coli, cos-концы соединяются с образованием кольцевой молекулы. На раннем этапе литического цикла в результате репликации кольцевой молекулы ДНК образуется линейная молекула, состоящая из нескольких сегментов длиной 50 т. п. н. Каждый из таких сегментов упаковывается в белковую головку, к последней присоединяется уже собранный отросток и образуется новая фаговая частица. При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т. п. н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т, п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку. В результате исследований по изучению сборки фага λ была разработана система упаковки молекул ДНК in vitro с образованием инфекционных фаговых частиц. Смешав в пробирке очищенные пустые головки, фаговую ДНК и собранные отростки, можно получить инфекционные фаговые частицы.