Специализированные векторные системы

Для экспрессии, секвенирования, интеграции хромосом. Для кажд случ разные.

специализированные векторы (секвениро-вание и мутирование генов, изучение особенностей регуляции клонированных генов, идентификация в клонируемой ДНК про-

большинство векторов носит специализированный характер, т. е. их приспосабливают для решения узкого круга задач. Например, векторы, предназначенные для экспрессиигенов, содержат около сайтов клонирования мощные промоторы, причем экспрессия может быть регулируемой или нерегулируемой (конститутивной). Присутствие в таких векторах специальных сигнальных последовательностей обеспечивает секрецию продуктов клонируемых генов. Малокопийные векторы позволяют изучать, например, механизмы регуляции клонируемых генов, а мультико-пийные способны умножать (амплифицировать) их число в сотни и тысячи раз. Разработаны векторы для секвенирования нуклео-тидных последовательностей и для поиска в них определенных регуляторных сигналов — промоторов, терминаторов транскрипции, антитерминаторов и т. д. Векторы прямой селекции позволяют выживать только таким трансформантам, которые содержат рекДНК.

120.Векторные системы,применяемые применяемые при молекулярном клонировании в клетках прокариотических организмов:

Первые векторы для клонирования фрагментов чужеродной ДНК были получены с использованием бактериальных плазмид. Большая серия векторных плазмид, обозначенных символом pBR , создана на основе репликона природной плазмиды ColEI , придающей клеткам E. coli устойчивость к колицину путем его объединения с генами устойчивости к антибиотикам. Бактериальные клетки, несущие подобные комбинированные плазмиды, приобретали устойчивость к соответствующим антибиотикам, и их было легко отличить от бесплазмидных клеток путем простого посева на питательную среду с антибиотиками.

Векторы серии pBR322

Плазмида представляет собой кольцевую ковалентно замкнутую молекулу ДНК длиной 4363 п.о. Плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину (Tc) и ампициллину (Ap) , которые были перенесены в плазмиду pBR322 из плазмиды pSC101 и транспозона Tn3 соответственно. Оба этих гена являются селектируемыми генетическими маркерами плазмиды, т.е. позволяют проводить отбор бактериальных клеток с плазмидой pBR322 по их способности к росту на питательных средах в присутствии тетрациклина и (или) ампициллина.

Плазмида pBR322 содержит обеспечивающий ее стабильную репликацию в клетках E. coli участок ДНК, который включает область начала репликации (ori). В плазмиде pBR322 имеются несколько уникальных сайтов рестрикции. Встраивание в плазмиду клонируемых чужеродных фрагментов ДНК по сайтам рестрикции, расположенным в генах Ар или Tc (например, PstI или BamHI ), будет нарушать целостность этих генов и их функциональную активность. В результате происходит утрата бактериальными клетками, содержащими рекомбинантные плазмиды, устойчивости к соответствующим антибиотикам. По такому признаку легко различить бактериальные клетки, не содержащие плазмиды (не растут в присутствии ампициллина и тетрациклина), клетки с плазмидой, не содержащей вставки клонируемой ДНК (растут в присутствии обоих антибиотиков), и клетки с рекомбинантными плазмидами (в зависимости от локализации вставки могут расти на среде только с одним антибиотиков).

121. Типы векторов: плазмидные и фаговые векторы(В) природного и искусственного происхождения.

Плазмиды -- это внехромосомные автономно реплицирующиеся 2цепоч кольц молекулы ДНК. Это монорепликонные структуры. П. есть практически у всех бактерий. Одни из них содержат инф-ю, обеспечив их собственный перенос из одной кл в другую (F-плазмиды). F-плазмида имеет tra-оперон(придаёт клеткам «мужские» свойства), ц2 и ц3 последовательности. Ц2 и ц3-мигрирующие генетические элементы(перемещаются их копии). Получена Жакобом и Вольманом. R-плазмиды несут гены уст-ти к антибиотикам. Похожи на половой фактор. Множественные R-плазмиды трансмиссибельны. Обладают шир кругом хозяев (бактерии:сальмонелла, ризобиум, эррвиния). Пример – RP-4 плазмида. R-плазмида не взаимодействуют с хромосомой à исследователи исп-ли бактериофаг μ-транспозон. Его геном не имеет точки origin à не реплицируется. При попадании в клетку встраивается в хромосому (в любом месте). Размножается за счёт перетранспозиции àкак бы реплицируется. Может осуществлять трансдукцию. Плазмиды деградации несут специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов. Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (критические плазмиды). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Кажд из них содержит сайт нач репл-и (ori), без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна. Нек плазмиды представлены в клетке 10—100 копиями; они называются высококопийными. Низкокопийные плазмиды присутствуют в клетке в числе 1—4 копий. Как автономно реплицирующиеся ген. элементы плазмиды обладают всеми основными св-ми, которые позволяют использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Но довольно часто природ (немодифицированные, несконструированные) плазмиды бывают лишены некоторых обязательных для «высококачественного" вектора свойств. К таким важным свой-м относятся: 1 ) небольшой размер, поскольку эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. coli значительно снижается при длине плазмиды более 15 т. п. н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осущ вставка; 3) наличие одного или более селективных ген маркеров для идентификации реципиентных кл-к, несущих рекомб ДНК. Поэтому плазмид векторы приходится создавать с помощью генной инженерии. Фаговые вектора. Используются для работы с более крупными фраг-ми. Для этого были разработаны В-ы на основе бактериофага λ Ε. coli. После проникновения фага λ в клетку E. coli может реализоваться литический цикл-фаг начинает интенсивно размножаться и примерно через 20 мин клетка разрушается (лизирует) с высвобождением до 100 новых фаговых частиц. При альтернатив варианте развития событий фаг ДНК включ в хромосому Е. coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактер генами (состояние лизогении). Однако при недостатке пит в-в или иных неблагопр обстоятельствах интегрированная фаговая ДНК высвобождается, и запускается литич цикл развитии. Размер ДНК фага λ составляет примерно 50 т. п. н., причем значительная ее часть несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага λ, «вставшего» на литический путь развития. При исключении из хромосомы может захватываться часть генома (лактозный оперон). Можно получать фаговые частицы несущие почти любой элемент генома бактерий. Возможность создания В-ов на основе фага λ связано с тем, что гены центральной части не существенны для литического развития. При использ фага есть необходимость удалять лишние сайты рестрикции. Используют вектор с одним сайтом для крупнощепящей рестриктазы – В-ы внедрения (сюда вставляют чужеродный фрагмент). Для увеличения ёмкости сконструированы Вы замещения. Здесь между левым и правым плечами фаговой ДНК есть балластный фрагмент, ограниченный сайтами для крупнощепящих рестриктаз. Потом балластный фрагмент удалятся и заменяется на клонируемый.