Метод создания гомополимерных окончаний при получении рекомбинантных молекул ДНК.

Коннекторный метоо. Этот метод позволяет объединять любые двунитевые фрагменты ДНК путем ферментативного наращивания на их концах однонитевых комплементарных участков (рис. 8.3). Именно с его помощью была сконструирована первая рекДНК (Jackson et al., 1972), положившая начало генетической инженерии. Суть данного процесса сводится к следующему. Фрагменты ДНК и линеаризованный вектор с концами любого строения обрабатывают экзонуклеазой фага А для "обнажения" 3' концов. Это облегчает течение последующей реакции, когда терминальная дезоксирибонуклеоткдилтрансфераза наращивает на З'-концах фрагментов однонитевые гомополимерные участки из 10—30 звеньев, используя добавленный в среду определенный де- зоксирибонуклеозидтрифосфат. Если синтезированные участки у разных фрагментов состоят из комплементарных нуклеотидов, то фрагменты могут объединяться с их помощью. В местах соединения фрагментов из-за неодинаковой длины гомополимерных "хвостов" получаются однонитевые бреши или избыточные однонитевые концы. Ранее эти дефекты исправлялись in vitro репарационными ферментами — ДНК-полимеразой I, экзонук-леазой III и ДНК- лигазой, после че,го образовавшимися рекДНК трансформировали реципиентные клетки.

Самым простым вектором можно считать плазмиду кишечной палочки, относящуюся к группе колициногенных факторов, детерминирующих у кишечной палочки синтез антибиотика колимицина. Из кольцевой плазмида превращается в линейную структуру, в которой имеются "липкие" концы по отношению к фрагментам чужеродной ДНК. Липкие концы должны иметь комплементарные основания, они соединяются водородными связями независимо от структуры и происхождения ДНК. Затем с помощью ферментов - лигаз образуется плазмида, которая называется рекомбинантной (с включенным участком чужеродной ДНК). Описанная процедура, в ходе которой чужеродная ДНК встраивается между двумя концами плазмидной ДНК с помощью фермента, называемого ДНК-лигазой, достигается методом ГОМОПОЛИМЕРНЫХ КОНЦОВ.

Метод гомополимерных концов основан на присоединении к 3' - концам цепей, образующих двуцепочечную ДНК, коротких отрезков одноцепочечной ДНК с регулярной последовательностью (гомополимерных). Если каждый подобный гомополимер состоит из нуклеотидов одного вида и если два таких гомополимера с взаимно комплементарными основаниями присоединены соответственно к плазмиде и к ДНК, то последние, оказавшись рядом, замкнутся друг на друга с образованием рекомбинантной плазмиды.

В простейших макромолекулярных цепях все звенья одинаковые - такие цепи наз. гомополимерными; к этому классу относится большинство распространённых синтетич. макромолекул.