Использование линкерных полинуклеотидов в технологии клонирования ДНК.

Рестриктазно-лигазный метод

1) рестриктазой класса II специфически разрезают молекулы ДНК на фрагменты, имеющие идентичные взаимокомплементарные липкиеконцы;

2) препараты различных молекул ДНК, гид-ролизованных одной и той же рестриктазой,смешивают, и при определенных условиях лип-кие концы разных фрагментов ДНК реассоции-

руют за счет комплементарного взаимодействия;

3) с помощью ДНК-лигазы происходит ко-валентное связывание ассоциированных фраг-ментов ДНК.По такой схеме могут быть ковалентно сое-динены in vitro два и более любых фрагмента,полученных при гидролизе молекул ДНК однойи той же рестриктазой. Однако с помощью

рестриктаз (особенно одного фермента) в каж-дом конкретном случае можно получить лишь специфический, строго определенный наборфрагментов изучаемой ДНК. Первоначальноэто в некоторой степени ограничивало приме-нение рестриктазно-лигазного метода. Но затемполучила распространение новая его модифи-кация, основанная на использовании линкер-ных молекул — синтетических сегментов ДНК,содержащих в своем составе последовательнос-ти, узнаваемые рестриктазами. Метод предло-жили Р. Шеллер с сотрудниками в 1977 г. Онпозволяет достаточно просто рекомбинироватьin vitro практически любые фрагменты ДНК.

Разработанный подход включает следущиеоперации

1) по тупым или липким концам фрагментаДНК, который предполагается рекомбиниро-вать, с помощью лигазы фага Т4 пришиваюткороткие синтетические двухцепочечные сег-

менты, имеющие участки узнавания определен-ной рестриктазы;

2) полученный фрагмент обрабатывают вы-бранной рестриктазой, в результате чего обра-зуются липкие концы;

3) полученный фрагмент рекомбинируютin vitro с другими молекулами ДНК по обычнойсхеме рестриктазно-лигазного метода. Использование линкерных молекул делает рестриктазно-лигазный метод рекомбинации фрагментов ДНК in vitro универсальным, по-скольку исходные фрагменты можно получатьсамыми различными способами.

При отсуствии комплементарных липких концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т е синтезируют искусственно-ферментативным путем. Для этой цели применяют линкеры (переходники) – короткие участки ДНК, имеющие липкие концы. Линкерные фрагменты не только обеспечивают обьединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторно-генетический элемент, наприм промотор или участок, связывание с рибосомой.

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестректирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК. Разрезают новую молекулу нужной эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вуктор. Прежде чем проводить встраивание, рестрекцированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой и сшивают с помощью ДНК-лигазы и фага Т4.