Фазмиды и их применение

При выполнении определенного типа экспе-риментов по созданию и изучению геномныхклонотек удобно использовать фазмиды — мо-лекулярные векторы, являющиеся искусствен-ными гибридами между фагом и плазмидой.Фазмиды после встройки чужеродной ДНК мо-гут в одних условиях развиваться как фаги,а в других как плазмиды. Максимальный размер фрагментов ДНК,которые можно клонировать в фазмидах, обыч-но несколько меньше допустимой величинывстройки для векторов на основе ДНК фага Я(этот размер легко высчитать, зная величинувектора; см. 2.2.2). Фазмиду выделяют из кле-ток в виде плазмиды, гидролизуют определен-ной рестриктазой и лигируют с продуктаминеполного гидролиза изучаемой ДНК, после че-го проводят упаковку ДНК в капсиды фага Я. Фазмиды имеют важные преимущества пе-ред векторами других типов, используемымидля создания библиотек генов. В отличие отвекторов замещения фага Я нет необходимостиотделять векторную молекулу ДНК от внутрен-него балластного фрагмента, что существенноупрощает процедуру подготовки векторак встройке чужеродной ДНК. Более того, этообеспечивает практически полное отсутствие

у фазмиды «фоновых» гибридов, которые обыч-но образуются у фаговых векторов, так какочень сложно полностью избавиться от заме-щаемого внутреннего фрагмента. В отличие откосмид фазмида типа ApMYF131 после лигаз-ной обработки не способна упаковывать в фаго-вые частицы свои димерные и тем более муль-тимерные формы, поскольку даже димер пре-вышает по размеру фаговую ДНК, способнуюк упаковке. Поэтому при использовании фаз-мидного вектора не требуются дополнительныеферментные обработки, которые обычно необ-ходимы для космид. Таким образом, применение фазмидныхвекторов упрощает процедуру получения и от-бора гибридных молекул ДНК, так как толькогибридные фазмиды могут образовывать набактериальном газоне фаговые бляшки. В отли-чие от космидной или фаговой векторных сис-тем фазмидный вектор существует в клеткев виде плазмиды, а клонотека получается и хра-нится в виде суспензии гибридных фагов. дляЛр]УП(Т131 —термоиндукция). Таким обра-зом, фазмиды являются векторами, обеспечи-

вающими возможность смены фаз, т. е. экспери-ментально регулируемого переключения разви-тия гибридных ДНК на фаговый или плазмид-ный путь.

Истинными гибридами плазмиды ( стабильно наследуемые внехромосомные генетические элементы)и фага являются фазмиды (молекулярные векторы)- линейные дуплексные молекулы ДНК, на концах которых расположены сегменты ДНК фага λ, содержащие все гены, требующиеся для литической инфекции, а ср.часть предст-на линеаризованной плазмидой. Т.е фазмиды содержат cos-сайт + плазмидные элементы. Также исп-ся для созданя банка генов. Ф-ции репликации как фага, так и плазмиды в фазмидах полностью сохранены. Обычно такие векторы содержат неск-ко тандемных повторов плазмидной части, обеспеч-х необходимую для упаковки ДНК протяженность генома.1 или несколько плазмидных повторов пр конструировании рекомб-х ДНК заменяют соответствующей вставкой.

Фазмидные ДНК перед инфицрованием упаковывают in vitro в фаговые головки. Попадая в клетку E.coli,фазмда реплицируется как фаговая ДНК, в рез-те чего на газоне чувствительных клеток образуются бляшки. Однако, если вектор содержит ген, кодирующий репрессор фага λ , то фазмида реплицируется как плазмида, а не как фаг. Существуют плазмиды, которые несут ген репрессора, кодирующего мутантный белок cI, инактивирующийся при повышю темпеатуре- температурочувствительный репрессор. В этом случае фазмида реплицируется, как плазмда пр низкой температуре и как фаг= при повышении температуры на несколько градусов.

((M13, f1, бактериофаг (одноцеп.ДНК) – адсорбируются на верхушке половой пили, через пил проникают в клетки (вирулентные). Репликация: у них +ДНК (информ, смысловая). На ней синтезируется 2 цепь- по тета типу.)