Химические методы иммобилизации ферментов

Главные отличительные признаки: в молекуле фермента возникают новые ковалентные связи, между ферм. и носителем.

Дост-ва препаратов, при хим.иммобил.:

1)формирующаяся ковалентная связь между ферментом и носителем обеспечивает высокую прочность образующихся конъюгатов.

2) изменение св-в фермента(субстр. специфичности, каталит. активности и стабильности).

Исп-т неорганические носители (керамика, стекло, железо, цирконий и титан) или природные полимерами (сефароза и целлюлоза), синтетические (нейлон, полиакриламид).

Основные требования, предъявляемые к материалам, которые могут служить для иммобилизации ферментов:

1) высокая химическая и биологическая стойкость;

2) высокая механическая прочность;

3) достаточная проницаемость для фермента и субстратов, большая удельная поверхность, высокая пористость;

4) возможность получения трубок, листов и т. п.;

5) легкая активация (переведение в реакционноспособную форму);

6) высокая гидрофильность, позволяющая проводить реакции связывания с ферментом в водной среде;

7) невысокая стоимость.

Используемые в настоящее время органические носители можно разделить на два типа: 1 - природные полимеры, 2 — синтетические полимерные носители.

Природные полимеры: доступность и наличие св-х функциональных групп, легко вступающих в разнообразные химические реакции, выс. гидрофильность. Недост-ки:неустойчивость к воздействию некоторых микроорганизмов и относительно высокую стоимость многих из них. (целлюлоза, декстран, агароза и их производные).

Синтетические полимеры используются для иммобилизации ферментов различными способами, а также для получения гелей и микрокапсул.

Полиамидные носители (с повторяющейся амидной группировкой). Дост-во: могут быть созданы в различной физической форме: в виде гранул, порошков, волокон, мембран, трубок и т.п.

96. Иммобилизованные клетки в биотехнологии:

Эффективность ферментативных процессов, используемых в самых раз-личных областях человеческой деятельности, удалось увеличить с помощью иммобилизации ферментов. Иммобилизованные ферменты обладают не-сколькими преимуществами над своими растворимыми аналогами:

1) могут быть отделены от продукта и использованы повторно, что снижает стоимость процесса;

2) характеризуются повышенной стабильностью и длительным со-хранением активности;

3) пригодны для непрерывных процессов, которые, в свою очередь, облегчают контроль за качеством и снижают стоимость труда;

4) время реакции может быть уменьшено за счет создания более вы-сокого соотношения ферментов и субстратов;

5) возможностью создания мультиферментных систем.

Однако применение ферментов ограничено из-за их низкой стабиль-ности, способности катализировать только одну единственную реакцию, высокой стоимости чистых препаратов. Кроме того, для практических целей могут использоваться только те ферменты, для которых не требуется регенерации кофакторов. Поэтому в настоящее время наряду с им-мобилизацией ферментов внимание исследователей все больше привле-кает иммобилизация клеток и органелл. Живая клетка в отличие от фер-мента представляет собой готовый биотехнологический реактор, в кото-ром реализуются не только процессы, приводящие к образованию конеч-ного продукта, но и многие другие, способствующие поддержанию ката-литической эффективности системы на высоком уровне (например, реге-нерация кофакторов). Поскольку ферменты функционируют в нативном окружении, их денатурация в процессе работы сводится к минимуму.

Это расширяет число применяемых ферментов и позволяет осуществлять как процессы синтеза, так и процессы деградации. Иммобилизованные клетки идеально подходят для использования в реакторах с перемешиванием, через которые пропускают субстрат. Пре-имуществом таких реакторов является возможность их многократного использования и получения продукта, свободного от фермента. Конечно, использование иммобилизованных клеток не лишено недостатков. На-пример, клеточная стенка или плазматическая мембрана могут препятст-вовать проникновению субстрата к ферменту или диффузии продукта из клетки. Кроме того, возникает необходимость поддержания целостности клеток и удержания их в той фазе роста, в которой синтезируются тре-буемые ферменты. Наконец, из-за большого числа присутствующих в клетке ферментов (что в ряде случаев рассматривается как достоинство)возможно протекание нежелательных побочных реакций.

Для иммобилизации клеток используется множество способов (сорб-ция инертными и ионообменными носителями, ковалентное связывание с полимерным носителем, включение в гель) и носителей разных типов (природные и синтетические полимеры и неорганические вещества). Вклю-чение живых клеток требует мягких условий иммобилизации, носитель при этом должен представлять собой систему открытых пор с хорошими условиями для газообмена. Следует принимать во внимание и возможное вредное влияние на жизнеспособность клеток сшивающих агентов. Наи-большее распространение получило включение клеток в полиакрила-мидный гель и гель альгината кальция. Альгинат – основной структурный полисахарид бурых морских водо-рослей. В присутствии моновалентных катионов полисахарид образует

вязкий раствор, тогда как в присутствии двухвалентных катионов, осо-бенно кальция, наблюдается образование геля. Поскольку гель образует-ся в мягких условиях, в нем можно иммобилизовать живые клетки.