Рестрицирующие эндонуклеазы, их основные характеристики область применения

Рестрикцияобусловлена расщеплением инфицирующей ДНК фага под действием фермента, специфичного для штамма-хозяина. Ферменты эти получили название рестрикционных эндонуклеаз или рестриктаз. Бла-годаря своему нуклеазному действию они препятствуют поддержанию чужеродной ДНК в бактериальной клетке. Если фаг проделал полный цикл репродукции в новом хозяине (в на-шем примере штамм E. coli C), то в дальнейшем в этом же хозяине он не подвергается ограничению, или рестрикции. Объяснить подобные факты можно следующим образом. В бактериальной клетке, кроме рестриктаз, синтезируются другие ферменты – метилазы, которые призваны защи-щать собственную ДНК от действия клеточных рестриктаз. Метилазы изменяют или модифицируют собственную ДНК путем метилирования или гликозилирования аденина либо цитозина. Этот процесс известен под названием модификации. ДНК бактериофага, прошедшего полный цикл развития в новом хозяине, под действием метилаз модифицируется таким же образом, как и ДНК клетки-хозяина. Она метилируется и при-обретает свойства, защищающие ее от воздействия рестрикционных ферментов данного штамма бактерий.

Следовательно, работающая в клетках бактерий система рестрикции-модификации (система R-M) образована двумя специфическими для оп-ределенного штамма микроорганизма ферментами – ДНК-модифици-рующим (аденин- или цитозинметилаза) и расщепляющим (рестриктаза).

Эти ферменты узнают в ДНК одни и те же определенные короткие по-следовательности нуклеотидов – сайты. Метилаза, модифицируя опре-деленные основания внутриклеточной ДНК, защищает ее от действия ре-стриктазы, узнающей ту же нуклеотидную последовательность.

Системы рестрикции и модификации широко распространены среди бактерий и найдены практически у всех исследованных видов. Недавно рестриктазы обнаружены и у некоторых видов дрожжей. Из разных штаммов микроорганизмов выделяют рестриктазы, различающиеся меж-

ду собой характером действия на ДНК.

В настоящее время все известные рестриктазы в зависимости от потребно-сти в кофакторах и характера расщепления нуклеотидных последова-тельностей ДНК разделяют на три типа: I, II и III.

Рестриктазы I типа являются сложными белками с тремя различ-ными типами субъединиц (эндонуклеаза, метилаза, фермент узнавания). Для действия этих ферментов в качестве кофакторов требуются АТФ, S-аденозинмонофосфат и ионы Mg2+. Расщепление ДНК совмещено с

гидролизом АТФ. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расще-пляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеоти-дов). В результате образуются самые разнообразные фрагменты ДНК,

или рестрикты. Такие рестриктазы невозможно использовать для реше-ния генно-инженерных задач.

Системы рестрикции и модификации II типа представлены двумя от-дельными белками (рестрикционная эндонуклеаза, модификационная метилаза). Рестриктазы II типа – относительно просто организован-ные белки, состоящие из двух субъединиц одного типа со сравнительно

небольшой молекулярной массой. Для специфического действия этих ферментов нужны только ионы Mg2+

. Рестриктазы II типа характеризу-ются тем, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают.

Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность ДНК и вызывает ее разрыв внутри этой последовательности. Сайты рест-рикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте

на 180º последовательностями – палиндромами.

Рестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости от размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК:

1) мелкощепящие – сайт рестрикции представлен 4 п.н.;

2) среднещепящие – сайт рестрикции – 6–8 п.н.;

3) крупнощепящие – сайт рестрикции – 10–14 п.н.

Рестриктазы II типа делятся на две группы в зависимости от того, ка-ким образом они расщепляютпоследовательность ДНК. Одни из них осуществляют прямой разрез ДНК (по оси симметрии). В результате образуются фрагменты ДНК с тупыми или ровными концами. Примером таких рестриктаз является эндонуклеаза BalI.

Рестриктазы, относящиеся ко второй группе, осуществляют ступен-чатый разрез (на некотором расстоянии от оси симметрии). В результате этого в месте разреза образуются неровные, или липкие, концы, т. е. ре-стрикты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные

участки. Примером таких рестриктаз является фермент EcoR1:

Рестрикты, полученные после воздействия на разные молекулы ДНК определенной рестриктазы, имеют одинаковые липкие концы. Такие ре-

стрикты могут объединяться друг с другом с образованием рекомбинант-ных молекул ДНК, что широко используется в генетической инженерии.

Рестриктазы III типа имеют некоторое сходство с рестриктазами I типа. Фермент состоит из двух различных субъединиц (эндонуклеаза, метилаза), и поэтому бифункционален, т. е. обладает как рестриктазной, так и метилазной активностью. Для проявления эндонуклеазной актив-

ности требуются только АТФ и ионы Mg2+. Расщепление ДНК не сопро-вождается гидролизом АТФ. Рестриктазы III типа гидролизуют ДНК на

расстоянии 20–39 п.н. от сайтов узнавания и поэтому также довольно редко используются для практических целей.

Ферментативная активность рестриктаз измеряется в единицах ак-тивности. Это такое количество фермента, которое необходимо для пол-ного гидролиза за один час 1 мкг ДНК фага λ при оптимальных услови-ях. Оптимальные условия рестрикции для каждой рестриктазы являются

индивидуальными и зависят от рН, ионной силы раствора, присутствия определенных ионов, температуры проведения реакции.

105.Способы «нарезания» фрагментов ДНК.(104).

Несколько способов «нарезания» в основанном с участием рестриктаз. Одна из первых рестрицирующих эндонуклеаз типа II была выделена из бактерии Escherichia coli и получила назваие EcoRI. Этот фермент узнает участок ДНК, содержащий специфическую палиндромную последовательность (последовательность-перевертыш, идентичную в обеих цепях при прочтении в направлении 5'-->3') из шести пар оснований и вносит разрыв между остатками гуанина и аденина в каждой цепи, расщепляя связь между атомом кислорода при 3'-атоме углерода сахарного остатка одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединенной к 5 '-углеродному атому сахарного остатка соседнего нуклеотида. Разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом (липкие концы). Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а 3'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена. Помимо EcoRI, из бактериальных клеток были получены сотни рестрицирующих эндуклеаз типа II. Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа II и в которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с «тупыми» концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.1). От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК; в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тетра- и гексануклеотиды. Рестрицирующие эндонуклеазы типа II играют ключевую роль при генном клонировании. Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов — при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов.