Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного. Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного (in vitro) имеет огромное значение в

Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного (in vitro) имеет огромное значение в решении ряда научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения жи­вотных.

Система оплодотворения in vitro может быть использована прежде всего как ценный аналитический инструмент для изучения биохимиче­ских и физиологических факторов, включающихся в процесс оплодотво­рения, соединения мужской и женской гамет. Только с освоением техни­ки оплодотворения вне организма появилась реальная возможность для широкого развертывания исследований по генной и клеточной инжене­рии и особенно сельскохозяйственных животных. Для этих целей необхо­димы эмбрионы на ранних стадиях развития, которые можно извлечь только хирургическими методами из яйцеводов, что является трудоем­ким и не дает достаточного числа зародышей для проведения этой рабо­ты. К тому же существующие методы гормональной регуляции воспроиз­водительной функции у сельскохозяйственных животных не позволяют достичь высокой точности контроля времени овуляции и вследствие это-208

го получить достаточное число эмбрионов на желаемой стадии развития. Методы клеточной и генной инженерии на животных предусматривают также проведение длительных манипуляций с гаметами и эмбрионами вне организма. Все эти проблемы могут быть решены в значительной сте­пени с использованием системы оплодотворения яйцеклеток млекопи­тающих вне организма.

Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает сле­дующие основные этапы: созревание ооцитов, капацитацию спермато­зоидов, оплодотворение и обеспечение ранних стадий развития.

Созревание ооцитов in vitro.Большое число половых клеток в яич­никах млекопитающих, в частности у крупного рогатого скота, овец и свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источник ог­ромного потенциала воспроизводительной способности этих животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с использованием воз­можностей нормальной овуляции. У этих видов животных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих спонтанно во время охо­ты, составляет только незначительную часть от тысяч ооцитов, находя­щихся в яичнике при рождении животного. Остальные ооциты регенери­руют внутри яичника или, как говорят обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нельзя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработки и провести их дальнейшее оплодотво­рение вне организма животного. В настоящее время не разработаны мето­ды использования всего запаса ооцитов в яичниках животных, но значи­тельное число ооцитов может быть получено из полостных фолликулов для дальнейшего их созревания и оплодотворения вне организма.

Явление спонтанного возобновления мейоза ооцитов, выделенных из фолликулов кролика и помещенных в культуральную среду, было впер­вые открыто Г. Пинкусом и Н. Энзманом (1935).

Известно, что после выделения ооцита из фолликула, как и после вы­броса эндогенного ЛГ в организме животного перед овуляцией, ооцит ос­вобождается из состояния мейотического торможения, что сопровожда­ется так называемым разрывом зародышевого пузырька. В организме крупного рогатого скота разрыв зародышевого пузырька происходит примерно через 5 ч после выброса ЛГ, ооцит достигает метафазы I через 12 ч и метафазы II через 24—25 ч. Вне организма ядерная мембрана заро­дышевого пузырька крупного рогатого скота также исчезает через 5—6 ч, через 12 ч хромосомы достигают метафазы I и через 20—24 ч — метафа­зы II.

Видовые различия в проявлении мейотического созревания ооцитов у коров, овец и свиней показаны в табл. 5.3.

Хотя большинство ооцитов, извлеченных из фолликулов яичников, возобновляют мейоз и достигают метафазы II, оплодотворение их часто не обеспечивает полноценного развития зародышей. Предполагают, что основной причиной этого является неполноценное созревание ооцитов.

Одной из причин может быть то, что при созревании ооцита in vitro в ци­топлазме не вырабатывается в достаточной мере фактор, контролирую­щий формирование и развитие мужского пронуклеуса. Считают, что для появления в цитоплазме ооцита фактора, вызывающего созревание муж­ского пронуклеуса, необходимо обеспечить индуктивное влияние нор­мального окружения ооцита в фолликуле в течение не менее 6 ч после на­чала мейотического созревания.

Таблица 5.3. Временные параметры проявления стадий мейоза ядра ооцитов разных видов животных на пре.ювуля горный выброс гонадотропинов

(Хантер, 1980)

Это было подтверждено в опытах по оплодотворению in vitro ооцитов свиней, извлеченных из фолликулов на разных стадиях мейоза. С про-грессированием стадии развития в момент извлечения ооцита из фолли­кула повышался процент нормально оплодотворенных зародышей: нор­мальное оплодотворение имело место у 31,7; 51,6 и 78,2 % культивируе­мых ооцитов со стадии зародышевого пузырька, диакинеза и метафазы I соответственно.

Установлено, что стероидные гормоны не требуются для запуска мей­оза у млекопитающих, но необходимы для полного физиологического со­зревания ооцита.

В связи с тем что стероидные гормоны и другие факторы, вырабаты­ваемые фолликулярными клетками, оказывают влияние на созревание ооцитов, было сделано предположение, что культивирование ооцитов с фолликулярными клетками может повысить их способность к нормаль­ному оплодотворению и последующему эмбриональному развитию. Многие явления внутри фолликула, включая биосинтез стероидов и син­тез белков, регулируют гонадотропные гормоны. Поэтому при культиви­ровании ооцитов внутри фолликулов или с фолликулярными клетками гонадотропины должны быть обязательной составной частью среды.

Необходимость прямого контакта между соматическими (фоллику­лярными) клетками и половыми клетками обусловлена целым рядом при­чин. Фолликулярные клетки играют важную роль в питании ооцита. Они обеспечивают энергетический субстрат ооциту, участвуют в переносе не­которых предшественников аминокислот, нуклеотидов и фосфолипидов в ооцит, генерируют инструктивные сигналы, которые влияют на ядро и прямой синтез определенных структурных белков. Инструктивные сиг­налы, требуемые для созревания ооцитов, как было показано выше, наи­более важны в первые 6—8 ч после инициации. 210

.» В настоящее время применение на практике нашло созревание in vitro только ооцитов крупного рогатого скота. Ооциты получают из яичников коров после убоя животных и путем прижизненного извлечения, 1—2 раза в неделю. В первом случае яичники берут от животных после убоя, доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение 1,5—2,0 ч. В лаборатории яичники дважды промывают свежим фос­фатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов, диаметр которых 2—6 мм, путем отсасывания или разрезания яичника на пластинки. Ооци­ты собирают в среду ТСМ 199 с добавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro только ооциты с компактным кумулюсом и однород­ной цитоплазмой.

В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или ла­пароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр кото­рых не менее 2 мм, 1—2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5—6 ооцитов на животное. Менее 50 % ооцитов пригодны для созревания in vitro.

Несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом извлечении возмож­ность многократного использования животного, с учетом информации о происхождении полученных ооцитов, открывает новые перспективы применения метода оплодотворения in vitro в практических целях.

Отобранные ооциты с компактным кумулюсом созревают в течение 24 ч в среде ТСМ 199 с добавлением 20 %-ной обработанной теплом сы­воротки крови от коровы в охоте, гранулезных клеток (3—5 ■ 10⁶ клеток в 1 мл) и небольшого количества антибиотиков (50 и.е. пенициллина, 50 мкг стрептомицина на 1 мл). Гранулезные клетки собирают из среды, в которой ооциты отделяют от фолликулов и центрифугируют дважды по 5 мин при 500g. Осадок гранулезных клеток суспендируется в среде для созревания. Сокультивирование ооцитов и гранулезных клеток проводят при 38,5°С в атмосфере 5 % СОг в чашках Петри в 2 мл среды.

Капацитация сперматозоидов.Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Аустин устано­вили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том слу­чае, если спермин в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проник­новения спермиев яйцеклетки крысы в различные сроки после спарива­ния Аустин ввел термин капацитации. Он означает, что в спермин долж­ны произойти некоторые физиологические изменения до того, как сперматозоид приобретет способность к оплодотворению.

В последующих исследованиях в лаборатории М.К. Чанга были не только определены оптимальные условия капацитации спермиев в поло­вом тракте самки, но и продемонстрирована возможность декапацитации

спермиев кролика, извлеченных из матки, обработанной семенной плаз­мой кролика, человека и быка, рекапацитации этих спермиев при внесе­нии их в яйцеводы и, наконец, удаления декапацитирующего фактора из семенной плазмы центрифугированием.

Капацитация включает начальное изменение мембраны спермия, что позволяет ему пройти вторую фазу (акросомную реакцию), а также слия­ние плазменной и внешней акросомной мембран. В настоящее время пер­вую фазу обозначают как собственно капацитацию, а вторую — как акро­сомную реакцию.

Показано, что у спермиев крупного рогатого скота происходит акро-сомная реакция исключительно в ампуле яйцевода, расположенной ипси-латериально к стороне яичника с овуляцией, и только во время или непо­средственно после овуляции. Эти наблюдения дают основание предпола­гать, что капацитация происходит преимущественно в яйцеводе, распо­ложенном на той же стороне, что и яичник с овулирующим фолликулом. Установлено также, что содержимое, извлеченное из яйцевода во время эструса, но не в лютеиновую фазу полового цикла у овец, вызывает капа­цитацию и акросомную реакцию спермиев быка.

Глюкозоаминоглюканы in vitro вызывают акросомную реакцию или капацитацию бычьих эпидидимальных спермиев. При анализе глюкозоа-миноклюканов в смывах яйцеводов крупного рогатого скота выявлена концентрация гепариноподобного материала.

В опытах in vitro установлено, что гепарин — наиболее потенциаль­ный глюкозоаминоглюкан по способности взывать акросомную реакцию у эпидидимальных спермиев быка и капацитацию эякулированных спер­миев.

В организме коровы все спермин, прикрепленные к прозрачной обо­лочке, были с акросомной реакцией. Кроме того, с помощью электронной микроскопии обнаружено, что спермин быка, найденные в окружении и непосредственно в кумулюсной массе, в яйцеводе сохранили акросомы в полном объеме и только спермин, прикрепленные к прозрачной оболоч­ке, имели акросомную реакцию. Эти данные свидетельствуют о том, что спермин быка капацитируются в яйцеводе, а оплодотворяющий спермий завершает акросомную реакцию около или в прозрачной оболочке.

Разработано несколько методов капацитации эякулированных спер­миев домашних животных. Для удаления белков с поверхности спермиев, которые, по-видимому, тормозят капацитацию спермиев, была использо­вана среда с высокой ионной силой.

Однако наибольшее признание получил способ капацитации сперма­тозоидов с использованием гепарина (Дж. Парриш и др., 1985). Пайеты с замороженным семенем быка оттаивают в водяной бане при 39°С в тече­ние 30—40 с. Примерно 250 мкл оттаянного семени подслаивают под 1 мл среды для капацитации. Среда для капацитации состоит из модифи­цированной среды Тиройда, без ионов кальция. После инкубации в тече-212

ние одного часа верхний слой среды объемом 0,5—0,8 мл, содержащий большинство подвижных сперматозоидов, удаляют из пробирки и про­мывают дважды центрифугированием при 500 g в течение 7—10 мин. По­сле 15 мин инкубации с гепарином (200 мкг/мл) суспензию разбавляют до концентрации 50 миллионов сперматозоидов в мл.

В Биотехцентре (Н.М. Сураева) было показано, что концентрация спермиев при всплывании стабилизируется уже в первые 5 мин и не меня­ется в течение последующего часа (табл. 5.4).

Таблица 5.4. Эффективность всплывания спермиев в зависимости от продолжительное ги инкубации

Таким образом, согласно табл. 5.4, можно значительно сократить про­должительность всплывания с 45—60 до 5—15 мин, что, в свою очередь, ускоряет, а значит, и облегчает оплодотворение. Были проведены опыты по оплодотворению вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота спермой, подвергшейся процедуре всплывания в течение 15 и 60 мин. Эксперименты с использованием двух интервалов инкубации показали, что продолжительность инкубации заметно не влияет на эффективность дробления оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогато­го скота.

Полученные результаты открывают перспективы повышения выхода живых спермиев из одной дозы размороженной спермы, так как появи­лась возможность проведения процедуры всплывания спермиев с одним и тем же осадком несколько раз без потери их жизнеспособности.

Используя прием многократной смены среды, можно в несколько раз (в наших опытах в пять раз) увеличить эффективность использования од­ной порции эякулята, что особенно важно при применении спермы от вы­сокоценных быков-производителей.

Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов.Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществля­ется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению усло­вий среды, в которой происходит процесс оплодотворения. Поэтому сис­тема оплодотворения in vitro была бы ценным аналитическим инструмен­том для изучения биохимических и физиологических факторов, вклю­чающихся в процесс успешного соединения гамет. Более того,

предполагалось, что эта система найдет применение в технологии разве­дения животных.

Крупный рогатый скот. Применяют следующую схему оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле модифициро­ванной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частично очи­щают от окружающих экспандированных кумулюсных клеток и перено­сят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 2—5 мкл добавляется к среде с ооцитами, чтобы достичь кон­центрации сперматозоидов в каплях 1—1,5 млн/мл. Через 44—48 ч после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают на монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.

Овцы. Оплодотворение у овец исследовали двумя путями: in vitro и введением фолликулярных ооцитов в яйцевод осемененной овцы. Как и у крупного рогатого скота, число оплодотворенных яйцеклеток было боль­ше в том случае, когда фолликулярные и овулировавшие ооциты помеща­ли в яйцевод со спермиями. При использовании системы оплодотворения in vitro таких клеток было меньше.

Ооциты культивировали в среде ТСМ 199 с 10 %-ной инактивирован-ной фетальной сывороткой с добавлением гонадотропинов (ЛГ и ФСГ) и эстрадиола — 17р. Затем ооциты оплодотворяют in vitro эякулированны­ми спермиями, капацитированными в течение 8 ч в модифицированной среде ДМ с добавлением 10 мМ буфера Хепеса. Хирургическим путем пе­реносят 2—4-клеточные эмбрионы в яйцеводы ложнобеременным кроли­кам. Через три дня ооциты из яйцевода кролика извлекают и пересажива­ют в матку постоянного реципиента.

С в и н ь и . К настоящему времени не известны какие-либо данные об оплодотворении in vitro ооцитов свиней. Вместе с тем некоторые ис­следователи наблюдали проникновение спермиев в ооциты свиней после созревания их in vitro и пересадки осемененной эстральной свиньи, но ни один ооцит не продолжал развитие и у многих из них проявилась поли­спермия.

Другие авторы сообщили о нормальном оплодотворении и развитии в аналогичной системе ооцитов, полученных из яичников свиней, обрабо­танных ХГ за 12 ч до ожидаемой овуляции. Можно полагать, что только после полного созревания ооцита в организме животного происходит блокирование полиспермии, нормальное оплодотворение и дальнейшее развитие эмбрионов этого вида.

Более успешные результаты достигнуты при культивировании ран­них эмбрионов свиней in vitro. Так, после 48 ч культивирования 1—4-кле-точных эмбрионов свиней и последующей их хирургической пересадки были получены беременности у двух из 13 свиней. После культивирова­ния 8-клеточных эмбрионов в течение 48 ч до стадии бластоцисты и затем 214

пересадки 19 свиньям-реципиентам 10 животных были беременны во время убоя через 21 день, но только 51 из 229 эмбрионов были представ­лены живыми плодами.