Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных

Принято считать, что успешная пересадка эмбрионов может быть осуществлена только между самками одного вида. Пересадка эмбрионов, например, овец козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты, по-видимому, за счет иммунологической реакции ма­теринского организма на инородные антигены плода. Эта несовмести­мость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помо­щью микрохирургии.

Сначала были получены химерные животные путем объединения бластомеров из эмбрионов одного вида. С этой целью получали сложные химерные эмбрионы овец объединением 2-, 4-, 8-клеточных эмбрионов. Каждый сложный объединенный эмбрион состоял из равного числа бла­стомеров эмбрионов от 2—8 родителей. При этом общее число клеток ко­лебалось от четырех- до восьмикратного увеличения нормального числа клеток. Эмбрионы вводили в агар и переносили в лигатированные яйце­воды овец для развития до стадии ранней бластоцисты. Нормально разви­вающиеся бластоцисты пересаживали реципиентам и получили живых ягнят, большинство из которых оказались химерными по данным анализа крови и внешним признакам.

Получены химерные овцы путем инъекций внутренней клеточной мас­сы, выделенной иммунохирургическим путем из эмбрионов доноров в бла­стоцисты эмбрионов реципиентов. Зону пеллюциду у бластоцист доноров удаляли инкубированием в 0,5 %-ной проназе и пипетированием.

Для восстановления их функции после обработки проназой эмбрионы культивировали в течение 3 ч. Затем эмбрионы без прозрачной оболочки культивировали в течение 1 ч в антисыворотке к клеткам печени овцы, три раза отмывали и помещали в раствор (1:4) сыворотки крови морской свинки на 1 ч. Лизированные клетки трофобласта удаляли пипетировани­ем, а изолированную внутреннюю клеточную массу вводили проколом инъекционной пипетки через зону пеллюциду в трофобласт бластоцисты реципиента. После пересадки этих бластоцист получены химерные ягня­та как по признакам групп крови, так и по внешним признакам.

Получены химеры и у крупного рогатого скота (Г. Брем и др., 1985) соединением половинок 5—6,5-дневных эмбрионов. Пять из семи телят, полученных после нехирургической пересадки агрегированных эмбрио­нов, не имели признаков химеризма. Один теленок был химерой двух по-

род — бурой швицкой и голштинофризской. Однако масть бурой швиц-кой породы доминировала. Анализ крови этого теленка показал присут­ствие групп крови только от родителей голштинофризской породы. Дру­гой теленок был химерой неопределенного происхождения.

Показана высокая эффективность получения химер крупного рогато­го скота объединением морул без зоны пеллюциды. Авторы получили хи­меры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой». В этих иссле­дованиях показано, что передача химерам родительского типа имеет слу­чайный характер, т. е. потомство может развиваться из клеток, происхо­дящих или от любого эмбриона, или от сочетания эмбрионов. Половина всех химер представляет собой интерес.

Наиболее показательно получение химер от объединенных частей эм­брионов разных видов, например, овцы и козы.

Исследования СВ. Фехилли и др. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4—5 сут в лигатиро-ванный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоци-сты. Эти бластоцисты жизнеспособны и могут развиваться до рождения нормального потомства. В первом опыте в результате объединения по од­ному бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась получением семи потомков. Все потомки были похожи в основном на ягнят, но у трех из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирующие с плотно вьющейся шерстью.

" 5.2.4. Клонирование животных

Число потомков от одной особи, как правило, у высших животных бывает небольшим, а специфический комплекс генов, определяющий вы­сокую продуктивность, возникает редко и в последующих поколениях претерпевает значительные изменения.

Вместе с тем известно, что ядро соматической клетки обладает пол­ной генетической информацией о данном организме, и если создать усло­вия для реализации этой информации, то можно получить практически неограниченное число генетических копий (клонов) определенной особи. Поскольку ядра большинства соматических клеток находятся в диффе­ренцированном состоянии, то эту задачу на первом этапе решали, ис­пользуя эмбриональные клетки на определенной стадии развития заро­дыша, когда еще не произошла их дифференциация. Пересадка ядер (бластомеров) в зрелые ооциты дает такую возможность, потому что ци­топлазма ооцитов содержит специфические факторы, способные репро-граммировать пересаженное ядро и запускать программу развития но­вого эмбриона.

Получение однояйцовых близнецовимеет большое значение для животноводства. С одной стороны, увеличивается выход телят от одного 216

донора, а с другой — появляются генетически идентичные двойни. Полу­чение идентичных двоен в большом количестве могло бы облегчить оценку быков по качеству потомства, уменьшить стоимость спермопро-дукции, ускорить и удешевить тестирование препаратов и упростить ис­следования в области кормления животных.

Возможность микрохирургического разделения эмбрионов млекопи­тающих на ранних стадиях развития на две и более части, чтобы каждая в последующем развивалась в отдельный организм, была высказана не­сколько десятилетий назад. Первое потомство однояйцовых мышей было получено из механически изолированных бластомеров двухклеточных эмбрионов в 1970 г. Используя ту же технику разделения, но с примене­нием метода заключения в агар, СМ. Вилладсен (1979) описал получение однояйцовых двоен у овец разделением 2-клеточных эмбрионов. После­дующие эксперименты показали, что одинаковые двойни могут быть так­же получены из 4- и 8-клеточных эмбрионов разделением бластомеров на две группы (СМ. Вилладсен, 1980). Половинки из 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов так же жизнеспособны, как и нормальные эмбрионы овец. Их можно хранить в замороженном состоянии, что позволило применить их в эксперименте для получения монозиготных двоен разного возраста.

Выживаемость четвертей эмбрионов клетки или 8-клеточных эм­брионов на четыре пары клеток ниже, чем нормальных. Выживаемость эмбрионов, полученных из отдельных бластомеров 8-клеточных эмбрио­нов, почти нулевая.

Установлено, что бластоцисты, полученные из половинок эмбрионов, состоят из 32 клеток, т. е. составляют лишь 50 % нормального числа кле­ток. Отдельные бластомеры из 4-клеточного эмбриона также способны развиться в бластоцисту. Однако бластоциста из такой четверти состоит из 16 клеток и меньше.

На 8-клеточной стадии каждый бластомер имеет потенциальную воз­можность развиваться в бластоцисту, но очень маленького размера, при­мерно из восьми клеток. При пересадке таких бластоцист менее 10 % из них развиваются до стадии рождения.

На основе этих исследований можно предположить, что резкое уменьшение числа клеток эмбриона является основным фактором, пони­жающим способность этих эмбрионов развиваться в жизнеспособные бластоцисты, хотя стадия развития, на которой происходит разделение, имеет малое значение.

После того как для эмбрионов большинство животных заканчивается компактизация морулы, защита со стороны зоны пеллюциды становится несущественной. Поэтому последующие разработки по получению моно­зиготных двоен были направлены на использование поздних морул и бла­стоцист.

В настоящее время применяют простую технику разделения эмбрио­нов на различной стадии развития (от поздней морулы до вылупившейся

бластоцисты) на две равные части одновременно с разрезом зоны пеллю-циды. При этом не выявлена существенная роль присутствия зоны пел-люциды для эффективности развития разделенных бластоцист.

Использование эмбрионов на более поздних стадиях развития у круп­ного рогатого скота для получения однояйцовых близнецов облегчается тем, что их извлекают нехирургическим способом.

Простая техника разделения разработана и для 6-дневных эмбрионов свиней. При этом стеклянной иглой разрезают внутреннюю клеточную массу эмбриона и примерно 40 % зоны пеллюцида. Затем разрезают слой трофоэктодермы внутри зоны пеллюциды. Одну половинку эмбриона в собственной зоне пеллюциды, а другую без зоны пеллюциды пересажи­вают в рог матки 6-дневного реципиента на расстоянии 5 см от маточ-но-трубного соединения.

Техника разделения на половинки эмбрионов успешно применяется на овцах и на козах.

Деление на стадии поздней бластоцисты считается более удобным, так как блестящая оболочка тоньше и цитоплазма эластичнее, чем у ран­ней бластоцисты.

При разработке оптимальных условий получения монозиготных близнецов большое внимание уделялось продолжительности культиви­рования in vitro после разделения и трансплантации половинок эмбрио­нов, а также их хранению в замороженном состоянии.

Установлено, что продолжительность культивирования половинок эмбрионов более 4 ч снижает результативность их последующей прижив­ляемое™. Культивирование in vitro половинок эмбрионов крупного рога­того скота в течение 24 ч снижает их приживляемость примерно в три раза по сравнению с культивированием in vitro в течение 4—6 ч.

Разделенные эмбрионы коров могут храниться в замороженном со­стоянии.

Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки.После пересадки ядер эмбрио­нальных клеток в энуклеированные яйцеклетки ядро репрограммируется таким образом, что начинает развиваться новый эмбрион. Теоретически все бластомеры из эмбриона донора имеют одну и ту же генетическую ос­нову и, таким образом, способны обеспечить развитие идентичных осо­бей. Эмбрионы, развившиеся после пересадки ядер, в свою очередь, мо­гут быть использованы как доноры ядер. После нескольких генераций создается возможность получения сотен и даже тысяч идентичных эм­брионов.

Клонирование эмбрионов путем пересадки ядра включает три основ­ных этапа: выделение интактного ядра донора, энуклеацию ооцита, пере­садку ядра в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от амфибий пере­садка ядра у млекопитающих не стимулирует ооцит. Поэтому требуется четвертый этап — активация ооцита и слияние мембран яйца и ооцита. 218

Под действием электрического импульса происходит активация ооцита и слияние мембран между ядром клетки донора и энуклеированным ооци-том-реципиентом. Технология пересадки ядер клетки способствовала ус­пешному получению клонированных живых кроликов, мышей, овец, коз, крупного рогатого скота и свиней. Было показано, что только эмбрионы на предимплантационной стадии являются тотипотентными, но эффек­тивность этой технологии пока низка. У крупного рогатого скота была продемонстрирована следующая эффективность этой технологии на каж­дом этапе (%): энуклеация — 70—80, развитие морулы-бластоцисты кло­нированных эмбрионов — 20—30. В исследованиях К.Р. Вондиоли (1991) 190 эмбрионов с пересаженными ядрами были получены из одного эмбриона путем многократной пересадки ядер из последовательно кло­нированных эмбрионов. Однако последовательные пересадки ядер после четвертого цикла сопровождались высокими эмбриональными потерями в матке. В итоге не удалось получить телят от пересадки эмбрионов, по­лученных после третьего цикла клонирования.

При использовании в качестве доноров ядер более продвинутых в раз­витии эмбрионов крупного рогатого скота 6-дневного возраста (47—68 бластомеров), по сравнению с использованием малоклеточных эмбрио­нов того же возраста (около 30 бластомеров), достигается более высокая эффективность слияния бластомера и ооцита, дробления эмбрионов и развития до стадии бластоцисты (В.И. Захарченко и др., 1996). Эффектив­ность развития клонированных эмбрионов крупного рогатого скота выше при использовании в качестве источника бластомеров морул на стадии прекавитации. При этом свежевымытые морулы являются лучшими до­норами ядер, чем развившиеся in vitro.

Осложняет пересадку ядер эмбриональных клеток получение телят с большой живой массой примерно на 15—30 % больше, чем у контроль­ных животных. Это приводит к тяжелым родам (рождение мертворож­денных телят, задержке выхода последа).

Пересадка ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклет­ки имеет много преимуществ по сравнению с технологией разделения эм­брионов. Эти преимущества следующие: отдельные эмбриональные клетки, полученные из эмбриона на стадии до 64 клеток, могут быть ре-программированы в одноклеточные зиготы и давать множественные ко­пии генетически одинаковых животных; повторное клонирование путем пересадки ядер от клонированных эмбрионов повышает потенциальные возможности технологии в производстве большего числа клонов.

Клонирование животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки.Накопленный опыт клониро­вания эмбрионов путем пересадки ядер тотипотентных клеток из эмбрио­нов в энуклеированные яйцеклетки послужил базой для разработки мето­да клонирования животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. Принципиальное отличие состоит в том,

Ill

что клонирование путем пересадки ядер эмбриональных клеток обеспе­чивает получение идентичных животных между собой, тогда как пере­садка ядер соматических клеток взрослого животного обеспечивает полу­чение не только одинаковых между собой животных, но и идентичных по генотипу с животным-донором соматических клеток. Это открывает воз­можность получать неограниченное число генетически идентичных по­томков уже в первом поколении. Нет необходимости объяснять, насколь­ко революционным может быть этот прием в селекции и разведении сель­скохозяйственных животных.

Возможность получения клонов животных с использованием ядер со­матических клеток была впервые продемонстрирована в 1977 г. получе­нием овцы Долли (Wilmul et al., 1997). Вильмут с коллегами транспланти­ровали ядра клеток молочной железы в энуклеированные яйцеклетки овцы.

С этого момента работы многих лабораторий мира была направлена на исследование способности репрограммирования клеток плода и взрос­лого животного.

Talbot et al. (1998) получили культуру фетальных фибропластов 100-дневного плода коровы и использовали для трансплантации ядер. Получены четыре стельных реципиента (7 %), которые впоследствии абортировали.

Heyman et al. (1998) получили двух телят из клонированных эмбрио­нов с ядрами фибропластов, взятых на мышцы и кожи плода. Однако эф­фективность развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты была очень низкой (3—8 %).

В опытах Zakhartcheto et al. (1999) эпителиальные клетки молочной железы и фибробластно-подобные клетки уха были получены от 2—3-летних симментальских коров и культивировались в среде ДМЕМ с 10 %-ной фетальной сывороткой теленка. После одного-пяти пассажей концентрация фетальной сыворотки уменьшалась с 10 до 0,5 % в течение 4—6 дней, чтобы вызвать голодание. Созревание ооцитов проводили по обычной методике (Stojkovic et al., 1995). Комулюсные клетки удаляли через 18—20 ч после созревания путем микропипетирования или обра­боткой гиалуронидазой. Ооциты с полярным тельцем энуклеировали пу­тем удаления минимального цитоплазматического объема. Через 20—22 ч отдельные донорские клетки сливали с энуклеированными ооцитами, ис­пользуя двойной электрический импульс, 2,1 kv/см в течение 10 с. Через 24 ч слившиеся кариопласт-цитопласт комплексы активировались 5-ми­нутной инкубацией в 7 %-ном этаноле с последующим 5-часовым куль­тивированием в 10 мкг/мл цитоксимида и 5 мкг/мл цитохалазина В. Кон­струированные эмбрионы культивировали в среде CRJ (Rosenkrans a. First, 1991) с добавкой 10 %-ной эстральной сыворотки коровы в течение 7 дней. . „■>■,. , _ь. _: •..... _: ,. ... ..._к-. ,. .. , . ■ , ■.,, .:

Таблица 5.5. Развитие in vitro эмбрионов с пересаженными ядрами, полученными из клеток взрослых животных (по Zakharteheto et al., 1999)

После пересадки бластоцист, полученных из клеток молочной желе­зы и уха, соответственно 100 % (2/2) и 42 % (5/12) исследованных реци­пиентов были беременны на 42-й день. Во время публикации два реципи­ента имели беременность более 4 месяцев (клетки молочной железы) и пять реципиентов — от 1,5 до 3 месяцев (клетки из уха) (табл. 5.5). Ре­зультаты показывают, что взрослые клетки крупного рогатого скота мо­гут быть успешно использованы для пересадки ядер, но клеточные ли­нии, используемые в этих исследованиях, отличаются по потенциальным возможностям и развитию. Различия в способности быть программиро­ванными, наблюдаемые с этими двумя линиями клеток могут быть из-за их импринтинга (отпечатка) или модификации хроматина.

Целью исследований Wells et al. (1999) было проклонировать послед­нюю оставшуюся островную корову в Исландии на острове Индерби с це­лью сохранения генетики самок этой эндогенной породы крупного рога­того скота, приспособленного к субтропическим условиям. Несмотря на то что семя от девяти уже не живущих быков было заморожено, попытки в последние шесть лет добиться воспроизводства у этой коровы заверши­лись рождением одного бычка, который был получен в результате опло­дотворения in vitro прижизненно извлеченных ооцитов. Качество яйце­клеток этой коровы было низкое, возможно связанное с ее возрастом (13 лет) или генетикой. Поэтому клонирование взрослого животного, воз­можно, являлось единственным приемом получения самок, которые по­том могут быть осеменены семенем исландского быка и создания воз­можности дальнейшей племенной работы с этой породой.

Клеточная линия была получена из гранулезных клеток, собранных путем аспирации фолликулов, используя ультразвуковой прибор. Клетки культивировали в OMEM/F12, содержащей 10 % фетальной сыворотки, и использовали для пересадки ядра между 4 и 8 пассажами. Донорские клетки были индуцированы голоданием сыворотки крови в течение 9—23 дней и подвергнуты электрическому слиянию с энуклеированными ооцитами, полученными после созревания in vitro.

Реконструированные эмбрионы затем активировали и стимулировали одновременно слиянием. Слившиеся эмбрионы культивировали в SOFa BSA и бластоцисты пригодного качества пересаживали по паре синхро­низированным реципиентам коровам через 7—8 дней после охоты.

После пересадки 74 эмбрионов, выживаемость эмбрионов на 30, 55 и 150 дни была 38, 30 и 23 %, соответственно. Из первых пересаженных 22 эмбрионов, родились два теленка. Однако один пал через два дня. Вы­живший теленок здоров. Микросателлитный анализ ДНК подтверждает, что телята являются генетически идентичными с островной коровой Ин-дерби. Дополнительные беременности развиваются.

Эти данные показывают, что развитие эмбрионов увеличивается в ре­зультате пролонгированного действия голодания ядер соматических кле­ток с цитоплазмой ооцита перед искусственной активацией, возможно облегчая ядерное ремоделирование и репрограммирование. Кроме того, дивалентные катионы улучшали степень электрического слияния клеток.

Корейские ученые использовали в качестве доноров ядер фетальные фибробласты (от плодов 60—70-дневного возраста). Линии клеток куль­тивировали, по меньшей мере, 7 пассажей. Эти клетки фибробласты, были определены нормальными по результатам хромосомного анализа (окрашивание 5 %-ной гимзой). Клетки были простимулированы голода­нием сывороткой крови в течение 4—5 дней до пересадки ядер. Все мани­пуляции проводили при комнатной температуре в течение 3 ч в конце со­зревания in vitro. Созревшие in vitro ооциты были энуклеированы после 22 ч созревания. Энуклеация была подтверждена под ультрафиолетом по­сле 10 мин инкубации с 5 мг/мл Hochest 33342. Реконструированные эм­брионы помещали в камеру для слияния в 0,28 М раствора манитола. Одиночный электрический пульс 1,75 kv/см в течение 20 ms применялся для одновременного слияния клеток и активации оопласта. Слившиеся клетки культивировали в течение 1 ч в 5 мг/мл цитохалазина В. Успешно слившиеся эмбрионы помещали в TALP, содержащий 4 мг/мл БСА без жирных кислот для культивирования in vitro эмбрионов, развившихся до компактной морулы.

Реконструированные эмбрионы успешно сливались (50/67; 77,8 ± 13,4 %), дробились (26/50; 55,3 ±21,5 %) и развивались до морулы/бластоцисты (11/26; 44,3 + 13,8 %). В предварительном исследовании две из вылупив­шихся бластоцист были окрашены 5 %-ной гимзой для подсчета клеток. В одной было 100, а в другой 70 клеток. 11 компактных морул, или бла­стоцист, были пересажены девяти реципиентам. Четыре реципиента были беременными (44,4 %), подтверждено ультразвуком на 40—50-й день. Один реципиент абортировал на 60-й день, а у других беременность продолжается.

Начиная с конца 80-х и в течение 90-х годов проводились широкие ис­следования по изучению возможности репрограммирования герминатив­ных клеток млекопитающих.

Stewart et al. (1994) получили линию эмбриональных герминатив­
ных клеток, которые имели характеристики эмбриональных стволовых
клеток, и использовали эти клетки при создании химер. Причем клетки с
геномом этой клеточной линии обнаруживались в популяции половых
клеток. ;.i.., • . -. , • ■ ■■ • '■ • ■ ■■ ■ ■-

V

Л

•♦«*'

Рис. 5.3. Соматические клетки (фетальные фибробласты), используемые

для клонирования кроликов ,

Однако первые эксперименты по трансплантации ядер герминатив­ных клеток млекопитающих были мало эффективны. Лишь 1,6—16,3 % реконструированных эмбрионов развивались до стадии бластоцисты (Delhaise et al., 1997; Heiman et al., 1998; Tsunoda et al., 1998). У кроликов клонированные эмбрионы не имплантировались (Moens et al., 1996). У мышей имплантировались, но не развивались до рождения потомства (Tsunode et al., 1989; Kato, Tsunoda, 1995). У коров реконструированные эмбрионы имплантировались, но на ранних стадиях развития (до 40 дней) беременность прекращалась (Delthaise et al., 1995; Moens et al., 1996; Laveir et al., 1997).

Однако в 1998 г. на конференции «Генетическая инженерия и клони­рование животных» в штате Юта (США) Stelchenko et al. (1998) доложили о рождении теленка, полученного методом трансплантации ядер герми­нативных клеток герминативной складки плода коровы 40—45-дневного возраста.

Исследователи использовали не свежевыделенные герминативные клетки, а после продолжительного культивирования, а также применили реклонирование первоначально полученных морул.

Zakharteheto et al. (1999) использовали свежевыделенные герминатив­ные клетки для трансплантации ядер в неактивированные оопласты. В ре­зультате развитие клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты дос­тигло 38 % и завершилось получением телят.

В наших экспериментах у кроликов ядра фе-тальных фибробластов репрограммировались и обеспечивали развитие эмбрионов до стадии бла-стоцистов с высокой эффективностью — 51 % (Galat et al., 1999) (рис. 5.4, 5.5, 5.6, 5.7).

В Биотехцентре РАСХН показаны различия в эффективности репрограммирования фибропла­стов, взятых из плода и взрослого кролика.

Фетальные фибробласты в качестве доноров ядер для трансплантации в энуклеированные яй­цеклетки были использованы и в работе со свинь­ями Du et al. (1999).

Собирали ооциты от суперовулировавших

свиней-доноров через 50—54 ч после инъекции ХГ и удаления кумулюса пипетированием и обработкой гиалуронидазы. Ооциты активировали и сливали одновременно через 54—56 ч, используя два повтора ВС пульсов (1,5 kv/см, 60 мкс х 2) с интервалом 30 мин с применением 0,3 М раствора маннитола, содержащего 0,1 тМ СаС1₂, 0,1 тМ MgSO₄ и 0,01 % PVA. Фибробласты получали от 25-дневных плодов и культивировали в ДМЕМ плюс 10 % фетальной сыворотки. Клетки с 3—5 пассажами были подвергнуты голоданию при культивировании в течение 5 дней с 0,5 % фетальной сыворотки. Эмбрионы с пересаженными ядрами культивиро­вали в течение 7 дней с 10 % фетальной сывороткой, добавленной на 96 ч. Эффективность развития очень низкая.

Аналогичная, низкая эффективность развития до стадии бластоцисты была в опытах Tao et al. (1999) — до 7%.

Таким образом, в настоящее время показано, что к репрограммирова-нию и обеспечению развития до стадии бластоцисты способны многие клетки взрослого организма: фибробласты (кролик — Mitalipov et al.,

I

Рис.5.5. Энуклеация: удаление ядерного материала ич яйцеклетки кролика

Рис.5.6. Клонированные бластоцисты кролика, полученные в результате пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки (Биотехцентр, РАСХН)

1998; Dinnyes et al., 1999; Lagutina et al., 1999; корова — Zakhartchenko et al., 1999; Vignon et al., 1999), клетки эпителия молочной железы (овца — Wilmut et al., 1997; Zakhartchenko et al., 1998, 1999), гранулезные клетки (мышь — Wakayama et al., 1998; корова — Collas, Barnes, 1994; Kato et al., 1998; Wells et al., 1999), клетки эпителия яйцевода (коро­ва — Kato et al., 1998); клетки Сертоли и нейрональные клетки (мышь — Wakayama et al., 1998). Однако потомство получено только при транс­плантации ядер клеток эпителия молочной железы (овца — Wilmut et al., 1997; корова — Zakharteheto et al., 1999), фибробластов (корова — Zakharteheto et al., 1999; Vignon et al., 1999), гранулезных клеток (мышь — Wakayama et al., 1998; корова — Kato et al., 1998; Wells et al., 1999) и клеток эпителия яйцевода (корова — Kato et al., 1998).

Успешная демонстрация пересадки ядер соматических клеток у жи­вотных расширяет возможности применения этой технологии для реше­ния новых задач в области воспроизводства и селекции сельскохозяйст­венных животных. При использовании удобных источников ооцитов и суррогатных самок эта технология может быть использована для сохра­нения других исчезающих пород животных, подобно тому, как это было продемонстрировано для сохранения эндогенной породы крупного рога­того скота, приспособленного к субтропическим условиям в Исландии (Wells et al. 1999), и будет способствовать разработке метода внутривидо­вой пересадки ядер клеток в будущем.

Использование этой технологии открывает большие возможности в повышении эффективности получения трансгенных животных, и биоме­дицине.

Резюмируя накопленные данные по клонированию животных,можно отметить, что успех развития реконструированных эмбрионов в значи­тельной степени обеспечивается согласованием стадии клеточного цикла донора ядер и цитоплазмой реципиента. Неадекватный выбор фазы кле­точного цикла реципиента или донора во время реконструкции может привести к разрушению ДНК и неправильной плодии реконструирован­ного эмбриона. Взаимосвязи между ядром донора и цитоплазмой реципи­ента происходят на многочисленных уровнях, которые в настоящее время изучаются. Установлено, что синхронизация отдельных бластомеров на ранней стадии развития является полезным инструментом для изучения взаимосвязи клеточных циклов у разных видов животных, включая кро­ликов (Collas P. et al., 1992), крупный рогатый скот (Campbell et al., 1993) и мышей (Otaegu P.J. et al., 1994). Синхронизация бластомеров на Gl/S-фазе и пересадка в ооциты на МII повышают эффективность разви­тия эмбрионов у многих видов животных, включая кроликов (Collas P. et al., 1992) и крупный рогатый скот (Tanaka H. et al., 1995). Однако в качест­ве рутинного метода для клонирования эмбрионов эта техника недоста­точно надежна, так как во время раннего развития в любой период време­ни большинство ядер в эмбрионе находятся на S-фазе клеточного цикла (Barnes F.L. et al., 1993). Если используются несинхронизированные бла-стомеры в качестве ядерных доноров, то наблюдается увеличение часто­ты развития, когда цитоплазма реципиента активирована и активность фактора, стимулирующего мейоз, понижена перед реконструкцией эм­бриона (Campbell K.H. et al., 1994). Предварительно активированный ооцит будет принимать Gl (GO), S- или О2-фазы клеточного цикла и оп­ределяется термином «Универсальный реципиент» (Campbell K.H. et al., 1993).

Анализ данных различных исследований, в которых были использо­ваны синхронизированные эмбриональные бластомеры в качестве ядер доноров, показывает, что донорские клетки на поздних стадиях G2 или ранней G-1 клеточного цикла являются наиболее пригодными для повы­шения эффективности развития (Kwen O.Y. et al., 1996).

5.3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ
5.3.1. Получение трансгенных животных;;

1.Микроинъекции гена. Получение трансгенных живот­ных путем микроинъекции гена включает извлечение эмбрионов на ста­дии пронуклеуса хирургическим путем или после убоя доноров. Для по­лучения оплодотворенных яйцеклеток, необходимых для микроинъек­ции, у животных гормональной обработкой вызывают суперовуляцию по 226

определенной для каждого вида схеме, а затем извлекают яйцеклет­ки, промывая яйцеводы у наркотизированных или убитых животных (G. Вгет, 1992).

Для микроинъекции эмбрионов необходим стабильный рабочий стол, на который устанавливают инвертированный микроскоп, два микрома­нипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микро­скопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой пара­финовым маслом. В среду помещают эмбрионы. Для инъекции эмбрионы по мере надобности посредством пониженного давления фиксируют на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хоро­шо виден. Кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр око­ло 1 мкм) наполняют раствором ДНК. Для инъекции пипетку через про­зрачную оболочку и клеточную мембрану вводят в пронуклеус, после чего в него инъецируют 1—2 пкл раствора ДНК. О точности операции су­дят по набуханию пронуклеуса. Только такое визуальное увеличение объема ядра свидетельствует о том, что раствор ДНК был действительно введен в пронуклеус. После инъекции эмбрионы освобождаются от удер­живающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам.

В оплодотворенных яйцеклетках мыши и кролика, извлеченных в со­ответствии со стадией их развития, пронуклеусы очень хорошо видны и могут быть легко инъецированы. У эмбрионов сельскохозяйственных животных в цитоплазме имеются темные липидсодержащие гранулы, ко­торые затрудняют визуализацию пронуклеусов. В результате центрифу­гирования при 15000 g в течение 3—5 мин (Wall R.J. et al., 1984) гранулы смещаются к одному полюсу яйцеклетки, а лежащие недалеко от центра пронуклеусы становятся видимыми и доступными для микроинъекций. Для эмбрионов овцы, как правило, не требуется центрифугирования: для визуализации пронуклеусов достаточно применить оптику Номарского с интерференционным контрастом. Несмотря на такую обработку, микро­инъекция эмбрионов сельскохозяйственных животных все же сложнее и не может быть выполнена с такой же надежностью и эффективностью, как у мышей и кроликов.

После короткого (до нескольких часов) культивирования in vitro эм­брионы трансплантируют в яйцевод синхронизированных реципиентов. В качестве альтернативы можно использовать длительное культивирова­ние микроинъецированных эмбрионов с последующей пересадкой их в матку синхронизированных реципиентов.

Синхронизация реципиентов и доноров, от которых получают эм­брионы, является необходимым условием для успешного выполнения программ по переносу генов (эмбрионов), так как яичники, яйцеводы и матка должны находиться в соответствующей стадии, чтобы физиологи­чески обеспечить дальнейшее развитие пересаженных эмбрионов. Син­хронизация достигается спариванием с вазэктомированными (стериль-

ными) самцами, индукцией овуляции хорионическим гонадотропином человека (ХГ), «мягкой» суперовуляцией или лютеолизом желтого тела.

Микроинъецированные яйцеклетки переносят реципиенту хирурги­ческой трансплантацией, так как бескровный доступ к яйцеводам даже у крупных сельскохозяйственных животных, кроме коров и кобыл, невоз­можен. С этой целью реципиентам под наркозом вскрывают брюшную полость, локализуют яичники и яйцеводы, контролируют реакцию яич­ников на индукцию овуляции (присутствие овуляционных клеток, жел­тых тел) для исключения непригодных (несинхронизированных) реципи­ентов. Затем специальный катетер с находящимися в нем микроинъеци-рованными эмбрионами вводят в яйцевод через воронку, после чего в ка­нал яйцевода инъецируют среду с эмбрионами.

Каждому реципиенту мыши, кролика и свиньи пересаживают 20—30 инъецированных зигот, причем у свиней все эмбрионы трансплантируют в один яйцевод, а у мышей и кроликов — раздельно по яйцеводам. У овец, коз и крупного рогатого скота каждому реципиенту пересаживают два-четыре эмбриона.

Животных, родившихся из инъецированных эмбрионов, индивиду­ально метят, берут у них пробу тканей или крови для доказательства ин­теграции ДНК. Интеграцию ДНК проверяют PCR-диагностикой, дот-, блотгибридизацией по Саузерну.

Для образования трансгенных линий животных решающее значение в животноводстве имеет получение таких трансгенных животных (транс­генные особи, родившиеся из инъецированных эмбрионов), все или, по крайней мере, часть половых клеток которых содержат трансген. При ис­следовании родившихся животных и полученного от них потомства было показано, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях (в пронук-леус оплодотворенных яйцеклеток), могут появляться мозаики. Мозаика­ми считаются животные, состоящие из двух или нескольких клеточных линий, происходящих из одной зиготы, но имеющих различные геноти­пы. Трансгенные мозаики кроме клеточных линий, содержащих транс-ген, имеют нетрансгенные линии. При получении от таких животных трансгенного потомства и при выделении трансгенных линий могут воз­никнуть трудности. Так, если клетки гонад не содержат трансген, потом­ство не может наследовать инъецированный ген от трансгенной роди­тельской формы. На основании существующих данных можно сделать вывод, что около 30 % первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции, являются мозаиками (Wilk; T.M. et al., 1986). Поэтому трансген не передается потомству с ожидаемой согласно закону Менделя частотой 50 %. Часть мозаиков вообще не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по на­следству.

В норме наследование трансгена соответствует законам Менделя для моногибридного скрещивания, так как в большинстве случаев интегра­ция происходит только в одной единственной точке одной хромосомы. 228

По этой причине «гетерозигота» здесь не применима, потому что на гомо­логичной нетрансгенной хромосоме отсутствует соответствующий трансгену аллель. Что касается мозаиков, то они появляются, как прави­ло, только в Fo-генерации. Животные Fi-генерации и последующих поко­лений (если они позитивные) содержат генную конструкцию во всех со­матических и эмбриональных клетках. Однако в нескольких случаях от­мечено нестабильное наследование трансгена через поколение.

Относительно редко в геноме первичных трансгенных животных на­блюдается сразу несколько точек интеграции. У трансгенного животного с двумя независимыми участками интеграции можно ожидать, что 75 % потомства будут наследовать трансген (при этом 25 % наследуют один из двух трансгенов и у 25 % в геноме присутствуют обе точки интеграции) и лишь 25 % потомства будут нетрансгенными. При спаривании гомози­готного трансгенного потомства в норме ожидается следующее расщеп­ление: 50 % гомозиготных, 25 % гомозиготных трансгенных и 25 % нега­тивных (нетрансгенных) особей.

Микроинъекция гена в пронуклеус зиготы до 1997 г. оставалась един­ственным надежным методом получения крупных трансгенных живот­ных. Впервые он применен для получения трансгенных мышей (Gordon J. et al., 1980) и позднее для получения крупных сельскохозяйственных жи­вотных (Hammer R.E. et al., 1985). Ввиду ограниченных экономических и технических возможностей этот метод вначале был доступен лишь еди­ничным лабораториям мира для применения его на крупных сельскохо­зяйственных животных и в частности на крупном рогатом скоте. Прове­дение микроинъекций генов в оплодотворенные in vitro эмбрионы круп­ного рогатого скота позволило заменить дорогостоящий прием, основан­ный на извлечении эмбрионов на стадии пронуклеуса хирургическим путем или после убоя суперовулировавших коров-доноров (Krimpenftort Р., et. al, 1991). Появление нового источника эмбрионов путем оплодотво­рения in vitro сделало метод микроинъекции генов доступным для боль­шого числа лабораторий, которые не имели возможности содержать ко­ров-доноров. Однако эффективность метода оставалась слишком низкой. Необходимо не менее 100 беременностей после пересадки микроинъеци-рованных эмбрионов, чтобы получить одно трансгенное животное, трансген которого был бы включен в геном животного и оно было спо­собно дать трансгенное потомство.

Эффективность микроинъекций у крупных домашних животных очень низкая (Wai R.J. et al., 1992), а высокая стоимость содержания боль­шого количества животных побудила исследователей искать новые под­ходы повышения эффективности трансгеноза.

Одним из таких приемов для повышения эффективности микроинъ­екции является идентификация интеграции гена в эмбрион до пересадки реципиенту. Предполагалось, что присутствие инъецированной ДНК мо­жет быть определено у эмбрионов на ранней стадии развития с помощью

ПЦР (Ninomija Т. et al., 1989). Однако эта техника оказалась неспособной отличить действительно трансгенные эмбрионы в связи с длительным (в течение нескольких дней) сохранением ДНК в неинтеграционной форме.

Другой подход был основан на определении активности репортерных генов, которые должны были экспрессировать только в том случае, если вся концентрация была интегрирована в геном. Некоторые из них базиро­вались на устойчивости к антибиотикам (Bondioli К., 1996), определении активности люциферазы(МепскМ.С. etal., 1998;NakamuraA. etal., 1998) или зеленого флюорисцирующего белка (GFP). Этот белок легко опреде­лить, но, к сожалению, его экспрессия не ограничивается только интегри­рованной ДНК и поэтому могут быть обнаружены как ошибочная поло­жительная, так и ошибочная отрицательная реакции.

Пересадка трансфицированных ядер открывает возможность пересаживать только трансгенные эмбрионы, так как при этом используются ядра клеток, отобранные на основе трансгенной инте­грации. В связи с этим, любой новорожденный организм, полученный по­сле трансплантации этих реконструированных эмбрионов, будет транс­генным и последующая селекция трансгенных эмбрионов не требуется.

Пересадка трансфецированных ядер дает еще другое преимущество, возможность прямой интеграции в специфическую область генома. При микроинъекции трансгены интегрируются в любую часть генома. Это оз­начает, что они могут разрушать весьма существенные гены или разме­щаться в частях хромосомы, недоступных для транскрипции и трансля­ции, и, кроме того, они никогда не будут экспрессироваться. С другой стороны, микроинъецированные конструкции могут только обеспечи­вать дополнительной информацией и тем самым только добавлять ин­формацию к той, которая уже имеется в геноме. Если ставится цель затор­мозить активность определенного эндогенного гена, то она достигается опосредованной стратегией как антисмысловая РНК или рибозомами. Пересадка ядра может принести пользу от всех других преимуществ «Knock-out» стратегией, которые позволили исключить активность эндо­генных генов у мышей. Применение стратегии «Knock-out» еще не осу­ществлено на крупных животных. Однако решение проблемы получения трансформированных плюропотентных клеточных линий у других видов животных возможно и это лишь вопрос времени.

Ретровирусные векторы.В опытах Chan A.W.S. et al. (1998) трансгенные телята были получены путем введения гена с ретро-вирусным вектором непосредственно в ооцит. Несмотря на то что эта сис­тема ограничена размером трансгенов в связи с ограничениями ретрови-русного вектора, она представляет альтернативный метод, по крайней мере, для тех видов, у которых возможно оплодотворение in vitro.

Использование сперматозоидов в качестве векторов экзогенного ДНК до последнего времени остает­ся противоречивой и спорной (Gandolfi. F. et al., 1998). Последние иссле-230

дования показали (Maiore В. et al., 1998), что разноречивые результаты могут быть получены при использовании одинаковой схемы исследова­ний, применяемой в разных лабораториях и даже в одной и той же лабора­тории.

Показано, что сперматозоиды являются не единственными зароды­шевыми клетками самца, которые могут быть использованы в получении трансгенов. В 1994 г. Brinster et al. продемонстрировали, как сперматого-нии могут быть взяты от одного самца и пересажены в семенники самца того же или другого вида и становятся функционирующими. Это дает возможность включения экзогенного гена в эти клетки до пересадки их в семенники другого животного. Трансформация линий зародышевых кле­ток самца in situ была сообщена рядом исследователей через прямую инъ­екцию ДНК в семенник живых животных (Kim J.-H. et al., 1997). Это мо­жет представлять интерес для видов животных, у которых перенос спер­матозоидов в семявыводящие канальцы технически невозможен.

Создание разных типов трансгенных животных.Мечтой многих исследователей-селекционеров мира является разработка возможности не просто отбора животных с измененной хозяйственно-полезной измен­чивостью, а преднамеренное изменение генотипа и направленное созда­ние желаемого типа животных. Это оставалось мечтой до тех пор, пока не были сделаны выдающиеся открытия — выявление ДНК как носителя ге­нетической информации, пока не были заложены основы рекомбинант-ной техники (открытие рестракционных энзим, клонирования ДНК и т. д.) или генной инженерии. В относительно короткие сроки были разра­ботаны методы выделения из генома отдельных генов, создания эффек­тивно функционируемых генных конструкций. В последующие годы были разработаны методы введения чужеродных генов в геном живот­ных — реципиентов. Селекционеры получили в распоряжение могучий инструмент для создания животных с совершенно новыми свойствами. Что касается применения переноса генов у сельскохозяйственных живот­ных, то надежды ученых в настоящее время связаны с улучшением про­дуктивности и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням и создания так называемых «генных форм» или трансгенных животных-биореакторов ценных биологически активных веществ.

Трансгенные животные с новыми хозяйст­венно-полезными свойствами. Одним из основных на­правлений генной инженерии на первом этапе было изменение наследст­венности животных в отношении увеличения скорости роста, повышения надоев и улучшение качества продукции.

Рост животного является сложным процессом, который зависит от действия генов, условий питания и факторов окружающей среды. С гене­тической точки зрения особенно интересны гены, кодирующие протеины каскада гормона роста, а именно, непосредственно гормон роста (ГР), ри-

лизинг фактора гормона роста (РФ — ГР) и инсулинподобный фактор гормона роста (ИФ ГР).

Еще в 40-е годы было установлено стимулирующее действие гипофи-зарного ГР на молочную продуктивность коров. Однако ввиду высокой стоимости препаратов гипофизарного ГР и невозможности его получения из гипофизов животных в больших количествах они не нашли практиче­ского применения.

К концу 70-х годов, с началом эры генной инженерии и появлением дешевых гормональных препаратов, полученных путем микробиального синтеза на основе технологии рекомбинантной ДНК, был синтезирован ГР. Было показано, что ГР микробного происхождения оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипо-физарный ГР.

При крупномасштабном применении рекомбинантного ГР (13 мг в день) увеличение удоев составляет 23—31 %. Разработаны формы препа­рата пролонгированного действия, позволяющие проводить обработку один раз в две недели и даже в месяц.

Ежедневные инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, сви­ней и овец вызывают увеличение суточных привесов на 20—-30 % и со­провождаются сокращением расхода кормов на единицу прироста. У мо­лодняка свиней ускорение роста сопровождается увеличением содержа­ния белка и уменьшением содержания жира в тканях, что повышает цен­ность мясопродукции.

Первые трансгенные мыши с геном ГР были получены в 1982 г. У них была установлена повышенная скорость роста (четырехкратная) и удво­енная конечная живая масса.

В противоположность результатам, полученным на мышах, у транс­генных свиней с геном ГРу Пурселя и др. (1988,1989) не наблюдалось со­ответствующего ускорения роста.

По сообщениям Л.К. Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном ри-лизинг фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7 % выше, чем у контрольных животных.

Известно, для ускорения роста свиней при инъекции ГР необходимо скармливать животным корма с повышенным содержанием протеина (18 % сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина. У по­томства трансгенных свиней, получавших соответствующий модифици­рованный кормовой рацион, наблюдались на 16,5 % более высокие сред­несуточные привесы (Г. Брем и др., 1991).

Трансгенные овцы с геном ГР и РФ ГР имели повышенный уровень ГР, но не обладали повышенной скоростью роста.

Вместе с тем, все авторы единодушно отмечают, что трансгенные свиньи имеют более чем двукратное уменьшение толщины шпика (18—20 мм у контрольных свиней против 7—8 мм у трансгенных). Ана-232

логичным образом трансгенные овцы имели 5—7 % жира по сравнению с 25—30 % у контрольных животных.

Разницу по скорости роста между трансгенными мышами и трансген­ными сельскохозяйственными животными некоторые исследователи объясняют следующим образом. В используемых для переноса генов ли­ний мышей не велась селекция по их ростовой продуктивности, тогда как большинство исследуемых свиней происходили из популяций, в которых в течение десятилетий велась селекция по этому показателю. Подтвер­ждением этого предположения является тот факт, что селекция мышей в течение 30 поколений по скорости роста сопровождалась удвоением у них живой массы. Они имели лишь незначительно меньшую конечную живую массу по сравнению с трансгенными мышами. Отсюда можно сде­лать вывод, что введение чужеродного гена ГР в популяцию линий мы­шей, не подвергнутых селекции на скорость роста, вызывает скачок на более высокое ростовое плато. В имеющихся популяциях свиней, наобо­рот, генетический потенциал роста, по-видимому, находится недалеко от потенциального плато и поэтому дополнительным введением гормона роста или переносом генов гормона роста можно добиться лишь сравни­тельно незначительного эффекта в скорости роста.

Более реальные перспективы улучшения качества или состава про­дуктов животноводства достигают введением соответствующих генных конструкций в организм животного. Рассматривается, например, возмож­ность уменьшения лактозы в молоке путем создания трансгенных овец или крупного рогатого скота, которые несут специфический для молоч­ной железы промотор, сцепленный с геном лактозы. При этом становится возможным расщепление лактозы (молочного сахара) на глюкозу в галак­тозу уже в молоке коров. Молоко таких животных может использоваться людьми, у которых отсутствует фермент лактозы.

Обсуждается также возможность введения генов, вырабатывающих определенные антитела, которые предотвращают маститы.

Все исследователи отмечают увеличение содержания белка и умень­шение содержания жира в тканях трансгенных животных с генами гормо­на роста, что заметно повышает качество и товарную ценность получае­мых мясопродуктов. По сообщению В.Г. Пурселя и др. (1989), толщина шпика у трансгенных линий свиней на спине в области 10-го ребра соста­вила 7,4 ± 2,3 мм по сравнению с толщиной шпика у контрольных живот­ных (сибсов) 21 ± 1,7 мм. По данным Л.К. Эрнста (1996), содержание жира в туше трансгенных свиней было на 10,5—13,1 % ниже, чем у кон­трольных.

Эти исследования дают основание предполагать, что молекулярные
методы повышения продуктивности и особенно улучшения качества про­
дукции будут играть важную роль в зоотехнической науке и в развитии
животноводства в целом. w.-- *

Трансгенные животные с устойчивостью к заболеваниям. Потери, вызванные заболеваемостью у сельскохо­зяйственных животных, составляют более 10% стоимости продукции. Поэтому все более важное значение приобретает селекция животных по резистентности к заболеваниям. Резистентность — это наследственная генетически обусловленная восприимчивость животных к определенным микроорганизмам, вирусам, паразитам или токсинам.

К сожалению, попытки вести селекцию на устойчивость к разным за­болеваниям не дали радикальных результатов, хотя известны отдельные положительные примеры. Созданы, в частности, популяции крупного ро­гатого скота с примесью крови зебу, которые устойчивы к ряду кровепа-разиторных заболеваний. Резистентность к ряду заболеваний является по­лигенным признаком, как, например, трипанотолерантность определен­ных африканских пород крупного рогатого скота, которые, кроме рези­стентности к заболеваниям, отличаются хорошей жаровыносливостью и нетребовательностью к условиям содержания и кормления. Вместе с тем, имеются механизмы резистентности, которые основываются на единич­ных генах, как, например, резистентность к диарее у новорожденных поро­сят, обусловленная Е. coli K88, или резистентность к гриппу у мышей.

Это послужило основанием для получения трансгенных животных с чужеродными генами, которые, возможно, обеспечат невосприимчи­вость таких животных к отдельным заболеваниям.

Защитные механизмы от инфекционных заболеваний функциониру­ют путем препятствия вторжению возбудителя, или путем изменения ре­цепторов. Вторжению или размножению возбудителей препятствуют, главным образом, иммунные механизмы и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости, а также иммунологические способности различных молекул, таких, как интерферон, нейропептиды, гормоны и интерлейкины.

Одним из примеров гена резистентности является ген Мх мыши. Этот ген, найденный в модифицированной форме у всех видов млекопитаю­щих, вырабатывает у Мх⁺-мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Этот ген был выделен, клонирован и использован, в частности, для получения трансгенных свиней, которые экспрессировали ген Мх на уровне РНК (Г. Брем и др., 1991). Однако пока не получено данных об экспрессии у трансгенных свиней Мх-протеина и доказательства резистентности трансгенных свиней к вирусу гриппа.

В Голландии исследуется возможность получения трансгенных жи­вотных, способных повысить содержание лактоферина в тканях молоч­ной железы с целью повышения резистентности к маститу.

Большой интерес представляют исследования по получению транс­генных животных с генами антисмысловой (ас) РНК. Экспрессия анти-смысловой РНК в клетках приводит к последующей гибридизации со 234

смысловой РНК и, следовательно, к ингибированию репликации виру-сального генома.

Т.И. Тихоненко была создана конструкция гена антисмысловой РНК против аденовируса и в Биотехцентре (М.И. Прокофьев) получены транс­генные кролики. На культуре клеток из почек этих животных было пока­зано, что клеточные линии, содержащие трансгенную антисмысловую РНК, имели на 90—98 % более высокую резистентность против Ads по сравнению с контрольными линиями клеток.

В других экспериментах этой же группы ученых продемонстрирована устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК про­тив лейкоза крупного рогатого скота к заражению вирусом лейкоза. У трансгенных кроликов с геном антисмысловой РНК против лейкоза круп­ного рогатого скота, зараженных антигеном р24, уровень антител был значительно ниже и не превышал титр 1 : 500 по сравнению с контроль­ными, у которых он изменялся в пределах 1 : 6000 — 1 : 8000.

Показана возможность создания внутриклеточной иммунизации против инфекционных вирусов. Эндогенные вирусные белки, в особен­ности их мутационные формы, могут служить защитой от соответст­вующих вирусов. В частности, получены трансгенные куры, устойчи­вые к вирусу лейкоза, у которых в клетках экспрессировался белок ви­русной оболочки.

Приведенные выше данные открывают реальные перспективы повы­шения резистентности трансгенных животных к заболеваниям.

Применение техники трансгеноза для у л у ч -шения состава молока. Одним из наиболее эффективных пу­тей расширения рынка и кардинального снижения стоимости производ­ства молочных продуктов может быть улучшение состава молока путем получения трансгенных животных. В результате генетической селекции в последние десятилетия молочная промышленность достигла значитель­ного улучшения качества молочной продукции. Однако новые генетиче­ские успехи, основанные на традиционных методах селекции, слишком медленны вследствие длительного интервала между поколениями. Это ограничивается также низкой наследуемостью этих качеств, взаимоотно­шениями между ними и потому, что различные молочные продукты мо­гут быть получены от селекции в различных направлениях.

Большинство из наиболее важных изменений в составе молока были инициированы фармацевтической промышленностью. Коммерческий рынок для биореакторов, оцененный в размере 3 млрд. долларов в год, в США привлек интерес фармацевтической промышленности. Они вскоре реализовали потенциальную возможность синтеза и секреции молочной железы и несколько фармацевтических продуктов были синтезированы в молоке. Эффективность молочной железы в качестве биореактора на­столько высока, что стоимость продукции может быть многократно сни­жена даже если процесс очистки еще недостаточно эффективный.

Однако не только фармацевтические белки могут быть эффективно произведены в молочной железе. Биологически активные пептиды могут быть также получены с достаточно высокой эффективностью. Недавно у трансгенных кроликов был получен с молоком кальцитонин-пептид, от­ветственный за регуляцию обмена кальция и используемый при остеопо-розе (Мс Кее С. et al., 1998). Важным непрямым эффектом биофарминта, который ожидается в ближайшем будущем, могут быть изменения в об­ласти получения трансгенных продуктов с молоком, которые бы могли стать источником заботы о человеческом здоровье.

Традиционно стоимость молока оценивалась по содержанию жира, но эта концепция меняется и отдается предпочтение другим компонентам молока, как протеин.

Ценные изменения в составе молока могут быть достигнуты количе­ственно, путем изменения соотношения компонентов молока, или качест­венно, т. е. путем добавления других компонентов, не присутствующих в составе натурального молока, которые усилят его питательную ценность. В молоке четыре основных компонента: жир, белок, лактоза и транспорт­ный компонент. Несколько экспериментов с трансгенными мышами по­казали, что возможно получить молоко, которое более соответствует су­ществующему промышленному процессу и требованиям потребителя и получить это можно в уже в первом поколении.

Качественные изменения в составе молока, достигаемые с помощью трансгенных живот-н ы х. Изменения в составе белка молока. С экономической точки зрения представляет интерес увеличение содержания казеина в молоке, в связи с его влиянием на производство сыра. Казеиновые мицеллы вовлекают жир и воду во время формирования сыра, играя, таким образом, важную роль в уменьшении к-казеина в молоке трансгенных мышей (Gutierrez — Adan A. et al., 1996), сопровождаясь значительным увеличением силы створажи­вания молока и уменьшением диаметра мицелл. Уменьшение диаметра мицелл должно привести к увеличению их поверхности, что в свою оче­редь способствует образованию более плотного творожного сгустка, ско­рости его формирования и увеличению выхода сыра. Эти измененные свойства молока представляют большую пользу и интерес для молочной промышленности.

Считается, что молочная железа имеет ограничения в способности синтеза белка. Любое дополнительное производство белка компенсиру­ется уменьшением количества эндогенных белков молока. Основываясь на этом, имеется другой возможный путь увеличения уровня казеинов, а именно, торможение производства других белков, представляющих меньший интерес. Для этой роли подходит Р-лактоглобулин. Этот белок присутствует только в молоке жвачных и является основным аллерге­ном молока коров. Поэтому уменьшение его количества могло бы улуч­шить состав молока. В целях уменьшения или торможения активности 236

определенного гена были использованы антисенсы к РНК или рибосомы (Sokol D.L. et ai., 1996).

Уменьшение уровня лактозы в молоке. Лактоза является основным са­харом в молоке и ответственна за нарушения пищеварения у большого процента популяции взрослых, когда уменьшаются уровни фермента лактазы во время отъема. Этот фермент гидролизует лактозу на моноса­хариды. Несколько промышленных приемов были направлены на полу­чение молока с уменьшенным содержанием лактозы в молоке после дое­ния. Это было бы полезно не только для человека, но и в молочной про­мышленности. Оно способствовало бы увеличению эффективности про­изводства сыра (Hettinga D.H, 1989).

Трансгенная технология пытается решить эту задачу несколькими пу­тями. Во-первых, некоторые эксперименты основывались на производст­ве молока с низким содержанием лактозы. С этой целью а-лактальбу-мин-дефицитные мыши были получены через гомологенную рекомбина­цию (Stinnakre M.G. et al., 1994), так как этот белок является одним из компонентов комплекса синтеза лактозы. Вследствие этой генетической манипуляции мыши производили молоко с низким содержанием или с от­сутствием лактозы. Однако этот сахар играет роль в регуляции осмотиче­ского давления молочной железы и поэтому проявлялся отрицатель­но — мало молока с высокой вязкостью и лактирующие животные были не способны прокормить потомство.

Другой подход уменьшения концентрации лактозы в молоке основан на вызывании ее гидролиза in vivo подобно тому, как это достигается в молочной промышленности in vitro, чтобы адаптировать молоко нетоле­рантным человеческим потребителям. Лактоза гидролизуется путем экс­прессии лактозы в тканях молочной железы. При этом одним приемом ре­шаются две проблемы, а именно, не нарушается продукция молока, так как осмотическая активность лактозы сохраняется, а концентрация этого сахара значительно уменьшается в молоке, не оказывая побочного влия­ния на молочные соски (Jost В. et al., 1999).

Качественные изменения в составе молока. Молоко наряду с прису­щей ему ценностью может быть использовано в качестве транспортного средства для других веществ, которые усиливают не только его питатель­ные, но также и функциональные свойства. Например, проявляется лак-тоферрин, кислый белок человеческого молока с бактериостатическими свойствами, который усиливает адсорбцию железа. Этот белок присутст­вует на очень низком уровне в молоке коров и увеличением его концен­трации могут быть достигнуты несколько целей. Например, получены трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий лактоферрин (Platenburg G.J. et al., 1994). В этих опытах показано, что лактоферрин увеличивает адсорбцию железа и защищает сохранность потомства, так

как ограничивает наличие свободного железа в межклеточном простран­стве тракта, контролируя, тем самым, размножение бактерий.

Этот подход позволяет получать гуманизированное молоко, легче пе­реводить его в молоко для новорожденных. С учетом этого получен транс­генный бык, несущий человеческий ген лактоферрина (Krimpenfort P. et al., 1991).

Бактериостатическое влияние может быть также достигнуто другими белками, направленными непосредственно в молочную железу и вызы­вающими уменьшение заболевания маститами. Например, лизоцим (Maga E.A. et al., 1995) оказывает не только антибактериальное влияние, но также способствует увеличению выхода сыра, вследствие его связи с казеинами. Возможно, он также вызывает специфический пассивный им­мунитет у новорожденных с секрецией специфических антител. Высокие титры нейтрализующих антител были получены в молоке трансгенных мышей против специфических вирусных агентов, вызывая экспрессию специфических иммуноглобулинов в молочную железу (Castilla J. et al., 1998).

Таким образом, в результате секреции человеческих белков в молоко коров возможно его гуманизировать и сделать более адекватным для по­требления человеком. Включения человеческого лактоферрина, челове­ческого лизоцима или человеческих иммуноглобулинов являются приме­ром такой гуманизации молока коров. Но эти включения имеют дополни­тельную терапевтическую пользу. Можно также заменить животный бе­лок его человеческим аналогом, не оказывая влияния на физиоло­гическую активность животного.

Трансгенные животные, продуцирующие биологически активные вещества медицин­ского и технологического назначения. Основа стратегии использования трансгенных животных как биореакторов со­стоит во включении в клетки организма генов, которые вызывают у них синтез новых белков, как правило, медицинского и технологического на­значения.

Раньше такие белки были выделены из тканей и биологической жид­кости тканей человека, таких как кровь (фактор свертываемости крови и другие белки крови) и гипофиз (гормон роста). Вследствие дороговизны и трудности получения человеческих тканей эти белки могут произво­диться в малых количествах и к тому же являются объектом ко